牛呼吸道合胞体病毒G和F蛋白的生物学功能

牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus, BRSV)是一种在世界范围内引起牛呼吸道疾病的病毒性病因之一,主要引起1岁龄以下犊牛的严重下呼吸道感染。BRSV共编码9种结构蛋白,其中附着蛋白(G蛋白)和融合蛋白(F蛋白)是BRSV表面主要的包膜糖蛋白,参与病毒吸附、融合宿主细胞的过程。G和F蛋白含多种识别表位,能够刺激机体产生中和抗体反应,常常是牛呼吸道合胞体病(bovine respiratory syncytial disease, BRSD)疫苗开发所关注的重点。探究G和F蛋白在BRSV侵染中的作用机理对于病毒致病机理分析、疫苗开发具有重要意义。本文旨在对牛呼吸道合胞体病毒G和F蛋白的结构功能及有关疫苗的开发加以综述,以期为BRSV疫苗的研制和BRSD的防控提供参考。

犬瘟热病毒F蛋白融合信号肽单克隆抗体的制备及其表位的鉴定

为制备犬瘟热病毒(CDV)F蛋白融合信号肽(FSP)的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达系统表达CDV HLJ1-13株重组FSP蛋白(rFSP)。将其免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌抗FSP蛋白MAb的杂交瘤细胞株G8D6E3E5,亚类鉴定结果显示该株MAb重链为Ig G2a型,轻链为κ型。构建一系列表达部分重叠的重组FSP片段,经western blot鉴定该株MAb识别的抗原区域为aa1~aa55,通过合成一系列重叠多肽,经ELISA进一步鉴定该株MAb识别的抗原表位为^(21)QQHSTRSTET^(30)。采用western blot检测该株MAb与r FSP的反应原性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测该株MAb与天然FSP的反应原性。Western blot结果显示,CDV Snyder Hill和HLJ1-13株r FSP蛋白样品在34 ku左右均出现特异性条带;IFA结果显示,感染CDV Snyder Hill株48 h后的vero细胞出现红色荧光。以上结果表明,该株MAb既能够与原核表达的CDV Snyder Hill和HLJ1-13株的r FSP蛋白反应,也能够与天然表达的CDV Snyder Hill株FSP蛋白反应。上述研究结果为CDV的检测以及FSP生物学功能的研究奠定了坚实基础。

表达呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的重组人5型腺病毒的构建

目的筛选并构建成功表达A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,HRSV)融合前构象F蛋白的重组人5型腺病毒(Recombinant Human type5 adenovirus,rHADV-5),为制备和研发HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定基础。方法在真核表达载体pcDNA3.1(+)上插入具有不同突变位点的HRSV F蛋白编码序列,利用融合前F蛋白单克隆抗体AM14和D25筛选HRSV F蛋白突变体;通过同源重组将筛选出的前构象F蛋白突变体编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,在HEK293细胞中进行重组病毒的包装和扩增,经氯化铯密度梯度法获得纯化的重组病毒;应用夹心ELISA法和Western blot鉴定F蛋白的表达及构象。结果通过AM14和D25单克隆抗体筛选出了2个稳定维持在融和前构象的HRSV F蛋白序列(SC-3M和SC-5M)。将SC-3M和SC-5M编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,对两种重组人5型腺病毒(pAd5-SC-3M和pAd5-SC-5M)和空载体(pAd5-vector)纯化,病毒滴度分别达到2.016×10^(10),2.52×10^(10)和2.948×10^(11)IU/mL。pAd5-SC-3M和pAd5-SC-5M感染HEK293后均能高效表达HRSV融合前构象的F蛋白并维持三聚体结构,且pAd5-SC-5M感染细胞中F蛋白表达量高于pAd5-SC-3M。结论成功在体外传代细胞中获得可高效表达A型HRSV融合前F蛋白的重组人5型腺病毒,为进一步通过动物试验评价该HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定了基础。

鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原的制备及其免疫保护效果的研究

为制备鼠疫耶尔森氏菌F1-V重组融合蛋白抗原,观察其免疫原性和免疫保护效果,通过疏水层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析纯化鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原.用氢氧化铝凝胶吸附制备试验性鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原,皮下接种健康BALB/c小鼠,ELISA检测血清F1-V抗体效价、MTT法测定淋巴细胞增殖能力,进一步用400LD50鼠疫耶尔森氏菌141标准毒株皮下攻毒,观察动物的存活情况.通过三步柱层析纯化获得的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原纯度达到90%以上.氢氧化铝凝胶吸附的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠三次,血清抗F1-V抗体效价为1∶(51200±800),对耶尔森氏菌141强毒株攻击的保护率是90%.上述结果表明,制备的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原具有良好的免疫原性和免疫保护效果,为研制鼠疫F1-V重组融合蛋白疫苗奠定了基础.

呼吸道合胞病毒融合蛋白F在重组杆状病毒表达系统中的表达及抗原性研究

目的利用杆状病毒表达系统对RSVA型Long株F基因进行表达研究,为RSV重组亚单位疫苗的研制奠定基础。方法用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增F基因,将其克隆到pFastBacHT A载体中,阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得含F基因的重组杆状病毒质粒,重组病毒感染Sf9细胞72h后,进行SDS-PAGE电泳、间接免疫荧光和Western-blot试验。免疫Balb/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT试验检测T淋巴细胞增殖。结果目的蛋白F在昆虫细胞中有特异性表达,能被F蛋白单克隆抗体所识别,该蛋白诱导了高滴度的RSV特异性抗体。结论成功克隆RSVF基因,并在Sf9昆虫细胞中获得表达,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究开发RSV重组亚单位疫苗奠定了基础。

犬瘟热病毒扬州分离株融合蛋白F和附着蛋白H基因的序列分析

根据Genbank犬瘟热病毒(CDV)毒株序列分别设计融合蛋白F和附着蛋白H全基因的2对引物,以2个CDV扬州分离株(CDV-YZ0101、CDV-YZ0102)为模板RT-PCR扩增出H基因和F基因2个片段,将其克隆进pGEM-Teasy载体,并进行序列分析。结果表明:H基因的开放阅读框架(ORF)为1 824 bp,2种分离株间核苷酸和编码氨基酸同源性达98％左右,与中国长春分离株、美国、日本分离株的同源性分别为96％、93％-95％和90％-91％。氨基酸分析显示扬州分离株与其他分离株的H蛋白有8-9个可能的天冬酰胺糖基化位点,而OP-CDV疫苗株只有4个类似位点。扬州分离株与长春分离株同属一个系,与美国、日本分离毒株以及疫苗株相比,均存在着明显的差异。F基因ORF为1 989 bp,不同毒株间的核苷酸及编码氨基酸差异主要表现在信号肽区域,而编码的F0前体蛋白表现出较高同源性(97％-99％),且所有的13个半胱氨酸残基、4个可能的天冬氨酰糖基化位点和2个疏水区域均完全一致。因此CDV F与H蛋白基因相比有很高的同源性,证明中国分离株与国外参考株有差异。

人呼吸道合胞病毒融合蛋白(F)片段原核表达、纯化和鉴定

目的克隆并表达人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州株的融合蛋白(F)基因片段。方法利用PCR技术扩增HRSV兰州株的融合蛋白基因片段,克隆于原核表达载体pET-42b(+),转化大肠杆菌(Rosetta),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化,SDS-PAGE和Western-blot分析重组蛋白的表达及其反应原性。结果 PCR扩增得到951 bp的DNA片段,重组质粒pET42b-F经酶切鉴定和测序分析,表明质粒构建正确。表达的重组蛋白的相对分子质量为68 710,表达的重组蛋白占总菌体蛋白的7%,纯化后蛋白纯度达80%。经Western-blot分析,重组蛋白与抗RSV的单抗呈专一性强阳性反应。结论成功构建了HRSV兰州株F基因片段原核表达载体,并在大肠杆菌Rosetta中获得了表达,表达的重组蛋白具有反应原性和特异性,为HRSV感染引起的疾病血清学诊断以及试剂盒的研发提供了材料。

鼠疫耶尔森菌F1-V融合蛋白改构体的构建、原核表达及纯化

目的：通过基于结构的基因突变获得鼠疫耶尔森菌F1抗原突变体（F1mut）,克隆、表达并纯化F1mut-V融合蛋白。方法：通过3轮PCR,将编码F1抗原分子N端1~14位氨基酸的基因序列移到3＇端,测序无误后将F1mut基因与V基因的5＇端连接,构建改构的融合基因F1mut-V,将其克隆到原核表达载体p ET-32a后转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后,目的蛋白为可溶性表达,通过硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析、疏水相互作用层析和凝胶过滤层析纯化,用SDS-PAGE和Western印迹分析纯化产物。结果：重组F1mut-V在大肠杆菌中为可溶性表达,表达量占全菌蛋白的25%以上,纯化后目的蛋白的纯度达95%,经Western印迹检测,与抗V、F1抗体均有特异性结合。结论：重组F1mut-V有望成为新一代亚单位疫苗的有效成分。

基于牛呼吸道合胞体病毒融合前F蛋白的间接ELISA方法的建立与应用

为确定牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)在我国的流行情况,本研究以BRSV融合前F蛋白作为包被抗原,经各项条件优化后建立了检测BRSV抗体的间接ELISA方法:确定抗原最佳包被浓度为2 mg/L、待检血清的最佳稀释度为1∶100、最佳封闭液为3%明胶、羊抗牛Ig G-HRP的稀释度为1:8000,抗体阴阳性临界值为0.204。特异性试验结果显示,该ELISA方法与阿卡斑病毒(AKAV)、牛轮状病毒(BRV)、蓝舌病病毒(BTV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)以及牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的阳性血清无交叉反应。敏感性试验结果显示,当BRSV阳性血清稀释倍数达1∶6400时仍为阳性结果,表明该方法具有较高的敏感性。重复性试验结果显示,ELISA组内、组间最大变异系数分别为6.80%和8.80%,表明该方法的重复性良好。对195份临床牛血清样品检测结果显示,BRSV抗体阳性率为61.0%;对其中的143份血清同时进行病毒中和试验检测,结果显示二者符合率为89.5%。上述结果表明本研究建立的间接ELISA方法可以用于牛群中BRSV抗体的检测,为BRSV的血清流行病学调查提供可靠的技术手段。

基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫效力研究

本试验旨在利用杆状病毒表达系统对基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)F基因进行表达研究。RT-PCR扩增F基因,将其克隆到pFastBac HT A载体中,阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得含F基因的重组杆状病毒质粒,重组病毒感染Sf9细胞72h后,进行SDSPAGE电泳、间接免疫荧光和Western blotting检测。免疫SPF鸡,间接ELISA测定抗体滴度,攻毒保护试验检测重组F蛋白保护性。结果显示,F蛋白在昆虫细胞中能够特异性表达,该蛋白诱导了高滴度的NDV特异性抗体,具有良好的免疫原性;重组F蛋白免疫组攻击保护率达到90%,明显高于阴性对照组。本研究结果为NDV新型亚单位疫苗的研究奠定了基础。

黄芩苷对RSV转录、复制及融合效应的影响

目的研究黄芩苷对呼吸道合胞病毒(RSV)复制、转录及融合效应的影响,探讨临床验方金欣口服液的药效物质基础。方法构建RSV感染的Hep-2细胞模型,黄芩苷干预后采用体外转录法、实时荧光定量PCR法及免疫荧光显微法分别检测黄芩苷对RSV的RNA聚合酶活性、核酸复制及RSV介导的细胞融合作用。结果在50μmol/L的最大无毒浓度下,黄芩苷对RSV的RNA依赖的RNA聚合酶活性、核酸复制、F融合蛋白表达及其介导的细胞融合效应无显著作用。结论黄芩苷不能抑制RSV的转录、复制及融合。金欣口服液治疗RSV肺炎的主要药效成分可能非黄芩苷而为其他含量较低成分或黄芩苷代谢产物,有待进一步确定。

北京地区人偏肺病毒融合蛋白F编码基因的序列分析

目的进一步了解北京地区人偏肺病毒(hMPV)编码基因的特征.方法在原先工作的基础上,从分属于hMPV的两个不同基因进化簇(即基因型)的两份临床标本BJ1816和BJ1887中扩增F蛋白全基因,克隆至pBS-T载体中并进行测序,与GenBank中hMPV的基因序列进行比较分析和种系进化分析.结果 BJ1816和BJ1887的F基因全长均为1620个核苷酸,编码539个氨基酸.BJ1816和BJ1887 F蛋白基因之间的核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为83.8%和94.4%,与同一基因簇内的hMPV有相当高的氨基酸同源性(98.3%～99.6%).BJ1816和BJ1887的F蛋白是典型的I型糖蛋白,具有与迄今已发现的hMPV相同的裂解位点(RQSR).BJ1816和BJ1887之间F2亚单位的氨基酸同源性高于F1亚单位的同源性(96.9% vs 93.8%);除位于羧基末端的跨膜区和胞质尾区外,F1亚单位的其余部分较保守(95.4%);糖基化位点保守.种系进化分析显示BJ1816和BJ1887属于不同的进化簇.结论 F蛋白的序列分析进一步证明BJ1816和BJ1887分属于不同的基因型,其F蛋白的基因特征与其他国外文献中所报道的hMPV相似,是病毒的膜表面糖蛋白,提示其在病毒的感染与免疫中起到重要的作用.

人偏肺病毒融合蛋白F的原核表达及初步应用

为了探讨人偏肺病毒（hMPV）融合蛋白（F）在原核表达系统中的表达效果及其应用价值,用大肠杆菌表达系统表达hMPV F1亚单位蛋白并用镍柱（Ni-NTA）进行亲和层析纯化,并以其为抗原,用Western Blot方法进行人血清抗体检测的探索。根据F蛋白的疏水性、抗原位点和表面可及性的预测结果选择F1亚单位为目标区域,在大肠杆菌BL21中分别得到了带有6个组氨酸（His）标记的不同基因型hMPV的F1亚单位蛋白的高效表达,目的蛋白大小约37.0 kD,主要以包涵体形式存在。Western Blot检测显示表达的目的蛋白可以特异性地结合抗hMPV的豚鼠多克隆抗体以及确定为hMPV急性感染患者的血清,而且与副粘病毒科肺病毒属的呼吸道合胞病毒（RSV）和副流感病毒（PIV）（2和3型）之间没有交叉反应,显示表达的F1蛋白的特异性和抗原性良好。应用该表达蛋白进行部分人群血清抗体检测的探索,结果显示人群血清抗hMPV-F蛋白的IgG抗体总阳性率约为66%67%,02岁组的血清抗体阳性率随年龄增长呈现逐渐下降趋势,新生儿的抗体阳性率最高,达85%左右,〉1岁2岁组幼儿阳性率最低,提示母传抗体的存在。随后各年龄组人群随年龄的增长血清抗体阳性率逐渐增高,〉60岁年龄组人群抗体水平最高,上述结果提示〈2岁儿童为hMPV的易感人群。

中试规模纯化重组鼠疫rF1-V融合蛋白及其免疫原性分析

重组F1-V融合蛋白(rF1-V)是目前在进行临床研究的鼠疫亚单位疫苗的主要成分。本研究摸索了rF1-V的可溶表达条件,并对条件进行了优化和放大,确定的中试发酵工艺为:在重组菌对数生长期中期加入50μmol/LIPTG,25℃诱导表达5h。通过硫酸铵分级沉淀、离子交换、疏水相互作用层析和凝胶过滤四步纯化,最终得到纯度为99%、回收率大于20%且各项检测指标合格的蛋白。在此基础上,将蛋白使用氢氧化铝佐剂进行吸附,在小鼠体内进行了免疫原性研究。ELISA测定两次皮下免疫后血清的抗体滴度。比较融合蛋白免疫组(rF1-V)与单一抗原免疫组(rF1、rV)以及联合抗原免疫组(rF1+rV)之间体液免疫反应的差异。结果显示:20μgrF1-V免疫剂量组诱导的抗F1抗体滴度明显高于其他组,抗V抗体滴度与其他组相比没有显著差异。表明本工艺制备的rF1-V抗原有望作为鼠疫亚单位疫苗的主要组分。

新城疫不同宿主源分离株的生物学特性

选择6株(鹅DCO1、鸡WJ10001、鸽DZ01、鸽DZ02、鸭NJ10、鸭SD09)分离自鸡、番鸭、鹅、鸽的新城疫病毒,接种于10日龄无特定病原体(SPF)鸡胚中,通过测定鸡胚平均死亡时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)及融合蛋白(F)裂解位点氨基酸序列,研究其生物学特性和分子流行病学特征。结果显示,6个分离毒株均为新城疫病毒(NDV)强毒株。对F基因的序列测定和遗传关系分析表明,2株鸭源NDV强毒株(鸭NJ10、鸭SD09)与1株鸭源NDV山东流行毒株(鸭SDWF2005)高度同源;2株鸽源NDV强毒株(鸽DZ01、鸽DZ02)与1株鸽源DNA强毒株(鸽JS2000)高度同源。6株不同宿主源毒株的基因型分别为VI型和VII型,是中国目前流行的NDV毒株型。

基于RSV对细胞的感染周期研究金欣口服液的干预作用

目的基于呼吸道合胞病毒(RSV)的感染周期观察金欣口服液含药血清对RSV感染细胞的干预作用。方法分别在RSV感染Hep-2细胞前后用含药血清干预,观察细胞病变效应、检测细胞存活率和病毒滴度,以及RSV的F融合蛋白表达,判断药物对RSV感染的预防及治疗作用。结果在RSV感染前或感染早期干预,金欣口服液对细胞病变抑制率均超过50%,与病毒对照组比较,细胞存活率显著增高,上清病毒滴度显著降低,后期干预只能延缓病变。金欣含药血清作用后F蛋白表达显著降低、融合病变较少。结论金欣口服液含药血清在RSV感染早期干预效果更显著,其抗病毒作用靶点可能与F融合蛋白或该蛋白在细胞上的相应受体有关。

呼吸道合胞病毒融合前F蛋白分泌表达条件的优化和建立

目的通过表达条件的优化,提高融合前呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F蛋白在HEK 293F细胞中的表达。方法将优化后的融合前RSV F基因片段插入到pLexm载体中,构建重组表达质粒,通过瞬时转染的方式将重组质粒转入HEK293F细胞中进行表达。对转染试剂线性化聚乙烯亚胺(polyethylenimine linear,PEI)与重组质粒的比例、添加丙戊酸钠(valproic acid sodium salt,VPA)的浓度以及收获时间进行摸索和优化,通过Western blot和ELISA检测目标蛋白的表达量,确定目标蛋白在HEK293F细胞中的最佳表达条件。结果成功构建了含有融合前RSV F基因的重组表达质粒,并确定在重组质粒质量浓度为3.0μg/mL,DNA∶PEI为1∶0.5,在转染后24 h添加终浓度为4 mmol/L的VPA,转染后第6天收获目的蛋白的表达量最多。结论成功构建了含有融合前RSV F基因的高效分泌表达载体,确定了目标蛋白在HEK293F细胞中的最佳表达条件,为研究融合前RSV F蛋白的特性奠定了基础。

白藜芦醇对呼吸道合胞病毒复制相关周期的影响

目的研究白藜芦醇对呼吸道合胞病毒(RSV)感染Hep-2细胞相关周期的影响,并探讨金欣口服液(麻黄、苦杏仁、生石膏、葶苈子、桑白皮、前胡、黄芩、虎杖)治疗RSV肺炎的物质基础。方法构建RSV感染Hep-2细胞体外模型,分为白藜芦醇处理组与未处理组,并以没有感染RSV的正常细胞作为对照组;采用体外转录法、荧光定量PCR法(qPCR)及激光扫描共聚焦显微镜法分别检测白藜芦醇对RSV的RNA聚合酶转录活性、核酸复制及诱导Hep-2细胞融合效应的影响。结果白藜芦醇在25μmol/L的最大无毒浓度下,能显著抑制RSV的RNA聚合酶活性,但对RSV复制、融合蛋白F表达无明显作用,亦不能抑制RSV介导的细胞融合效应。结论白藜芦醇在金欣口服液的抗RSV效应中发挥作用不是通过干预RSV复制相关周期,需要进一步研究。

副粘病毒HN蛋白颈部与F相互作用区功能的研究

副粘病毒（Paramyxovirus）包膜上镶嵌着两种糖蛋白血凝素-神经氨酸酶（Hemagglutinin-neuraminidase,HN）和融合蛋白（Fusion protein,F）,两者的相互作用是决定病毒宿主范围、毒力和传播的关键。为探讨HN颈部与F相互作用区（Fusion interaction region,FIR）在膜融合机制中的作用,选取新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）与人副流感病毒3型（human parainfluenza virus type 3,hPIV3）为研究对象,通过片段置换及同源重组技术构建嵌合体C1、C2,进一步将NDV及hPIV3HN的FIR内第51位丝氨酸（Serine,S）、第55位天冬氨酸（Aspartic acid,D）定点突变为丙氨酸（Alanine,A）,获得突变体NDV S51A、NDV D55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A,对嵌合体及突变体蛋白的细胞表面表达效率、受体识别活性、神经氨酸酶活性、促细胞融合活性及半融合活性进行检测。结果：各嵌合体C1、C2及突变体NDV S51A、NDV D55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A的细胞表达效率、神经氨酸酶活性（Neuraminidase,NA）与野生型相比差异不显著（P〉0.05）,但促细胞融合活性均有不同程度的降低（P〈0.05）,C1、C2、NDV S51A、NDV D55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A分别为野生型的7%、9%、27%、19%、17%和21%;C1、C2、NDV S51A、NDV D55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A的受体识别活性分别为14.7%、22.3%、35.5%、28.8%、33.9%和40.2%,与野生型相比差异显著（P〈0.05）。结果表明：副粘病毒HN蛋白颈部与F相互作用区的突变及置换使HN蛋白的促细胞融合活性、受体识别活性降低,其中第51位丝氨酸（S51）及第55位天冬氨酸（D55）发挥重要作用。

新城疫病毒融合蛋白胞内尾部关键氨基酸定位

新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病,具有很高的发病率和病死率,对养禽业危害极大。为了探讨新城疫病毒融合蛋白(Fusion protein,F)胞内尾部(Cytoplasmic tail,CT)后段的氨基酸(Amino acid,aa)在细胞融合中的作用,定位该区域影响F蛋白功能的关键氨基酸,本研究利用基因定点突变和体内同源重组技术构建7个突变体,经BHK-21细胞表达后,分别用间接免疫荧光法和流式细胞术定性和定量检测各突变体蛋白的表达效率,采用R18染料转移实验、指示基因法、吉姆萨染色对各突变体蛋白促细胞融合的三个阶段分别进行分析,并利用Western Blot检测突变体功能的改变是否与F蛋白的裂解活化有关。结果显示,与野生型F蛋白相比,突变体N542A、L544A、M547A的半融合活性均发生了显著变化,分别为野生型的189.8%、58.5%和17.3%,而突变体G540A、N541A、G545A、Q546A的半融合活性处于野生型的80.1%~117.5%之间(P均大于0.05)。突变体N542A、L544A、M547A的内容物混合能力分别为野生型的248.5%、62.2%和12.6%,其它突变体的内容物混合能力处于野生型F蛋白的95.8%~119.9%之间(P均大于0.05)。突变体L544A和M547A形成合胞体的大小与数目均有下降,其中M547A几乎丧失了形成合胞体的能力,突变体N542A形成的合胞体的能力则大幅上升。除了M547A的表达水平有所降低之外(为野生型的66.3%),其它各突变体F蛋白在细胞表面的表达水平均处于野生型F蛋白的91.3%~111.4%之间(P均大于0.05)。由此可见,NDV F蛋白胞内尾部N542、L544和M547为关键氨基酸,对F蛋白的融合活性起到了重要作用。