降糖多肽药物固相合成有关物质研究综述

近年来糖尿病患病人数日益增多,鉴于此,糖尿病类药物发展很快,尤其以多肽类药物发展最快,但大多数多肽药物在体内半衰期短,生物利用度低,因此寻找长效的降糖药物势在必行。目前多肽药物主要通过动植物中提取、化学合成和基因重组三种方式来制备,多肽药物化学合成方法是主要制备工艺之一,但化学合成过程中产生的有关物质会对产品质量有一定的影响。目前多肽药物主要采用固相多肽合成技术,该方法反应容器单一,容易实现自动化,但是该过程容易产生有关物质,并且多肽药物在合成、储存过程中,容易形成相关结构杂质,例如氨基酸丢失、氨基酸插入、保护基残留、氧化/还原等。本文主要介绍多肽药物有关物质,重点从固相合成工艺杂质方面展开综述,调研了国内外目前的研究现状,以期能探索出多肽药物其他的开发关键点,为这类药物的产业开发奠定基础。

胸腺五肽固相合成及免疫增强作用的研究

目的 合成有生物活性的胸腺五肽并研究其免疫增强作用。方法 用Fmoc固相肽合成法合成胸腺五肽 ,用E玫瑰花实验检测生物活性。合成的胸腺五肽经小鼠腹腔注射后进行淋巴细胞转化实验、溶血空斑实验及IL 2活性实验 ,研究其免疫增强作用。结果 合成 2批胸腺五肽 ,精肽产量分别为 2 7mg和 3 4mg ,具有生物活性 ,实验组动物脾淋巴细胞的转化率、空斑形成细胞及IL 2活性皆明显高于空白对照组。结论 用Fmoc固相肽合成法可以成功地合成有生物活性的胸腺五肽 ,且具有免疫增强作用。

固相合成胸腺五肽的研究进展

叙述了胸腺五肽TP5的药理、药代及毒副作用、市场状况和前景 ,分析了胸腺五肽各氨基酸的α -氨基保护基和侧链保护基的特点 ,并从固相载体、第一个氨基酸的连接、肽链延长等 3个方面介绍了Merrifield法、Boc法、Fmoc法 。

抗菌肽的固相合成、分离纯化与构效关系的研究

应用手工固相ＤＣＣ／ＨＯＢｔ法合成ＣｅｃｒｏｐｉｎＢ、Ｓｈｉｖａｌ１、ＡＢＰ３、ＷＨＤ４种抗菌肽。各抗菌肽的Ｃ端均为酰胺化。最终用ＨＰＬＣ分离纯化。这４种肽对大肠杆菌Ｋ１２Ｄ３１、野生型大肠杆菌、产气杆菌及４种植物病原菌青枯菌、临床致病型大肠杆菌、伤寒杆菌、硝酸盐杆菌均有明显的杀伤或抑制作用，对白血病细胞Ｋ５６０、肺癌细胞Ａ５４９也有杀伤作用。其中尤以ＷＨＤ杀伤作用最为明显，并用对其它３种肽不能作用的枯草杆菌、绿脓杆菌也略有抑制。而Ｓｈｉｖａ１对细菌的作用较其它３种肽弱。

Fmoc(9-芴甲氧羰基)法固相合成胸腺五肽

采用对碱敏感的Fmoc法α-氨基保护策略固相合成了胸腺五肽,并讨论了胸腺五肽不同固相载体、不同活化试剂对胸腺五肽固相合成的影响。试验结果表明Fmoc合成策略中各步的缩合率均在90%以上,同时对产品进行色谱分析,纯度达到83%。

微波促进催产素和赖氨加压素环肽的固相合成

以RinkAmide-MBHA树脂为载体,采用Fmoc/tBu正交保护固相合成策略,运用微波照射促进,先快速高效地合成得到载有催产素或赖氨加压素还原型多肽的树脂,再将连接在树脂上的各还原型多肽分别在微波促进条件下和常温条件下环合形成二硫键制得环肽,最后用ReagentK试剂将环肽从树脂上裂解下来得到目标多肽的粗品.利用HPLC法测定不同固相环合条件下得到的多肽粗品纯度,结果显示经微波促进固相环合得到的多肽粗品纯度明显高于常温条件下得到的多肽粗品纯度.粗品最后经过反相制备高效液相系统纯化并冻干得到目标多肽纯品,通过电喷雾质谱法测定了制得的还原型多肽及相应环肽的分子量,验证了它们的结构.

多肽固相合成的研究进展

多肽固相化学合成法是蛋白质研究领域非常重要的研究方法之一,主要可以分为Boc方法和Fmoc方法,在生物药物、蛋白质工程、免疫学等研究中得到了广泛的应用。该文论述了多肽固相合成法的原理,比较了两种典型合成方法的优缺点,介绍了适用于该方法的多肽种类,提出了多肽合成过程中存在的问题与解决策略,最后展望了多肽合成法的应用前景,以供相关领域的研究人员参考。

醋酸奥曲肽的固相合成

目的设计并合成醋酸奥曲肽。方法采用固相多肽合成法 ,使用逐步缩合的战略合成奥曲肽。结果与结论合成了醋酸奥曲肽 ,纯品总收率为 3 0 % (以连到树脂上的第一个氨基酸计 )。关键中间体及最终产物的结构经质谱、红外光谱、核磁共振氢谱及碳谱得到确证。

固相合成胸腺五肽(TP5)

采用Fmoc固相多肽合成中的活化酯方法和2,6-二氯苯甲酰氯(DCB)混合酸酐法,对Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH与Wang树脂反应中的反应级数和表观活化能进行了研究,并采用常规方法和微波强化方法分别进行了胸腺五肽的合成.实验结果表明,活化酯方法的反应级数为1.855,表观活化能15.24kJ/mol,混合酸酐法的表观活化能为35.14kJ/mol.与传统方法相比,微波将缩合反应速率提高了30倍以上,氨基酸过量倍数也从传统的三倍降低到两倍.

奥曲肽固相合成及环化的研究

为了研究用固相肽合成法合成奥曲肽(octreotide),采用CTC树脂为载体,Fmoc-哌啶保护基系统,并使用了逐步增长肽合成战略及碘氧化法对线性奥曲肽进行环化,通过反向高效液相色谱纯化.合成纯度达70.26%.结果表明:用固相肽合成法合成奥曲肽具有操作简单、可行、收率较高等特点,适合于工业化生产.

微波强化固相合成伐普肽

以伐普肽为研究对象,用固相合成方法,并对偶合反应进行微波强化.利用正交实验研究了微波强化对偶合反应的促进作用.正交实验结果用多元非线性回归分析和响应面法优化,确定优化条件为:反应时间5 min,包括1 min升温、4 min维持,最高反应温度60 ℃.与常规偶合反应相比,提高反应效率12～36倍.常规接肽反应保护氨基酸用量与固相合成树脂摩尔数之比为3倍,在优化的微波强化反应条件下,保护氨基酸用量减少为过量1倍;保护氨基酸与树脂的偶合效率明显提高,伐普肽得率从常规合成的48%提高到76%.其结构经质谱、高分辨质谱、红外光谱、核磁共振氢谱证实,与目标化合物的结构一致.

固相合成胸腺五肽的分离与纯化

胸腺五肽(TP5)是一种很有发展前景的药物,具有胸腺素的全部生理功能。固相合成法是胸腺五肽生产的主流技术,目前,对固相合成的五肽一般采用反相色谱技术纯化,但效率低、成本高,仅限于小规模制备。实验采用离子交换法纯化,并进行了方案优化,发现在pH4 4醋酸盐缓冲液平衡、盐梯度洗脱条件下纯化TP5,一步分离纯度可达98 23%。该法可以满足大规模制备的要求,且成本很低。

精子肽的固相合成及应用初探

目的 :探讨将多肽固相合成技术用于检测抗精子抗体的ELISA试剂盒制备。方法 :以多肽固相合成法合成特异性精子肽 ,并经高效液相纯化分析及质谱分析。以此合成精子肽包板制备检测抗精子抗体的ELISA试剂盒 ,检测血清标本的AsAb。结果 :HPLC结果显示 ,合成的精子肽纯度达 98 2 6%;质谱分析结果主峰分子质量与理论值一致。采用合成多肽抗原建立了检测抗精子抗体的酶联免疫吸附测定方法 ;不明原因不育患者组与对照组间AsAb发生率呈非常显著差异(P <0 0 0 5 )。结论 :本固相合成法可获得高纯度特异性精子肽 ;该精子肽包板的ELISA试剂盒可靠简便。

肿瘤靶向性细胞穿膜肽的固相合成及体外活性研究

目的采用固相合成法合成以基质金属蛋白酶为靶点的肿瘤靶向性细胞穿膜肽,用5-羧基四甲基罗丹明对其进行荧光标记,并对合成的产物进行生物活性和细胞毒性评估。方法采用N-芴甲氧羰基(Fmoc)作为α-氨基酸的保护基,以逐个延伸的固相合成法合成肿瘤靶向性细胞穿膜肽,并在有耦合剂HATU和DMF的情况下,加入5-羧基四甲基罗丹明进行荧光标记,应用高效液相色谱分析仪和质谱仪测定其纯度和分子量;荧光显微镜观察穿膜肽对体外培养的肝癌细胞株SMMC-7721和正常肝脏细胞株LO2的穿膜效果,以评价穿膜肽的生物学活性;MTT比色法检测穿膜肽对SMMC-7721细胞活性的影响。结果所合成的细胞穿膜肽经高效液相色谱法鉴定纯度为96.05%,经质谱鉴定相对分子量为3504.9。这种穿膜肽对正常肝脏细胞株LO2无明显穿膜作用,但对肝癌细胞株SMMC-7721有较强的穿膜作用,并且对细胞活性无明显影响。结论采用Fmoc固相肽合成法成功合成细胞穿膜肽;所合成的细胞穿膜肽具有肿瘤靶向性。

穿膜肽TAT的固相合成及体外活性研究

目的以固相合成法合成穿膜肽TAT,并对合成产物进行活性评价。方法采用Nа-芴甲氧羰基(fluorenyl-methyloxyloxycarbonyl,FMOC)作为α-氨基的保护基,以逐个延伸的固相合成法合成穿膜肽TAT。应用高效液相色谱和质谱仪测定其纯度及相对分子质量;荧光显微镜观察穿膜肽TAT介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,pEGFP)质粒在体外培养人脐静脉内皮细胞中的转染效果以评价穿膜肽TAT的生物活性;MTT法检测穿膜肽TAT与质粒DNA复合物对人脐静脉内皮细胞生长活性的影响。结果高效液相色谱和质谱鉴定所制备穿膜肽TAT的纯度为96.6%,相对分子质量1880。它能够携带质粒DNA穿过细胞膜进行基因转染,并对细胞活性无明显影响。结论采用Fmoc固相肽合成法可以成功地合成有生物活性的穿膜肽TAT。

固相法合成多肽AN-M的工艺研究

目的:探讨生物活性肽AN-M的固相合成工艺,并为工业化合成目的肽提供理论依据。方法采用固相法,以Fmoc-保护基保护的α-氨基酸和Wang树脂为原料,经1—氧—3—双二甲胺羧基苯骈三氮唑四氟化硼盐(TBTU)、1—羟基苯并三氮唑(HoBt)、二异丙基乙胺(DIEA)缩合,20%哌啶的DMF溶液脱保护,用切割试剂将AN-M粗品从Wang树脂上切割下来。结果经反相高效液相色谱分析纯化,可得目的肽的得率大于67．00%,最终成品的纯度在98．78%以上,经质谱鉴定其分子量与理论值一致。结论该合成方法步骤简便、便于操作、产品得率高,可用于大规模合成目的肽。

人胸腺肽α_1的固相合成及体外活性研究

目的对胸腺肽α1的固相合成工艺进行研究 ,并对合成产物进行活性评价。方法采用对碱敏感的Nα 芴甲氧羰基 (Fmoc)作为α 氨基的保护基 ,以Fmoc Asn(Trt) WangResin为起点 ,逐个延伸固相合成法合成胸腺肽α1。与Nα Fmoc 基团配套的保护策略还有 :叔丁氧羰基 (Boc)保护Lys的侧链氨基 ,叔丁酯基 (OtBu)保护Asp、Glu的侧链羧基 ,叔丁氧基 (tBu)保护Ser、Thr的侧链羟基 ,三苯甲基 (Trt)保护Asn的侧链酰胺基。采用DCC HOBt缩合剂法进行接肽反应 ,茚三酮定性显色法和水杨醛定量自由氨基检测法控制反应进程 ,肽段最后用TFA DCM(V∶V=1∶1 )定量地从树脂上切除。结果胸腺肽α1总产率为 3 3 2 %。纯化后的产物 ,经SDS PAGE和RP HPLC鉴定 ,纯度为98 8%以上 ,活性与日达仙对照品相当。结论Nα 芴甲氧羰基保护策略的固相合成方法操作简便、条件温和、副反应少 ,产品纯度高、收率高。

响应面法优化微波固相合成毛虾肽螯合钙工艺

采用响应面法优化微波固相合成毛虾肽螯合钙的工艺。结果表明,最佳的微波固相合成毛虾肽螯合钙工艺为:毛虾肽与乳酸钙的质量比为2.5∶1,微波功率420 W,螯合时间73 s,钙螯合率达到82.09%。

抗肿瘤肽AP-9的固相合成

建立了抗肿瘤肽AP-9的Fmoc固相全合成方法,产品纯度大于98%。着重研究了Fmoc-Arg(Pbf)-OH与H-Pro-Trt树脂的缩合反应。结果表明,以THF-NMP(1∶1)为溶剂,于30℃微波辐射反应6min,缩合产率达80.2%。

多肽的固相合成法研究进展

介绍了多肽的固相合成法,包括多肽合成原理、发展简史、固相多肽合成的分类、合成中常用的树脂、合成步骤、合成过程中可能出现的副反应以及较长肽链、某些蛋白质的合成策略。