酶标鼠疫F1 McAb在酶免疫染色法快速鉴定鼠疫菌中的应用

目的观察酶标鼠疫F1McAb在酶免疫染色法快速鉴定鼠疫菌中的应用效果。方法实验感染鼠疫强毒菌的病死小鼠和处死健康小鼠尸体 ,2 0℃以上室温放置 ,用鼠疫F1McAb酶免疫染色法检测 ,同时用细菌学检验方法分离鼠疫菌和反向血凝试验 (RIHA)检测鼠疫F1抗原。结果直接培养仅从 5d内的鼠尸分离检出鼠疫菌 ,阳性率为 5 3 .3 % ;动物实验检出鼠疫菌的最长时间为 8d ,阳性率为 71.6%。存放 13d内 ,酶免疫染色阳性率为 99.1% ,RIHA阳性率98. 2 % ,用酶免疫染色法和RIHA检测健康动物腐败脏器全部阴性。以上方法检查鼠疫疫区自毙动物标本 12份 ,酶免疫染色法阳性 7份 ,RIHA阳性 6份 ,动物实验阳性 5份 ,直接培养未获得阳性结果。结论酶免疫染色法检查动物腐败脏器中的鼠疫菌具有较高的敏感性和特异性。

鼠疫F1McAb酶免疫染色法快速检验鼠疫菌

为缩短检验鼠疫菌的时间 ,建立了酶免疫染色法检验鼠疫菌的方法 ,被检涂片标本用含过氧化物酶底物的固定液 ,固定标本同时 ,内源性过氧化物酶被消耗 ,辣根过氧化物酶标记鼠疫 F1单克隆抗体和鼠疫菌菌体表面的特异性 F1抗原结合 ,底物被酶催化生成有色沉淀物使鼠疫菌着色 ,用普通光学显微镜观察结果 ,常温 1h出结果 ,Kaplow法鼠疫菌被蓝色晶体覆盖 ,DAB法鼠疫菌呈棕黄色 ,不含 F1抗原的 8株细菌均为阴性 ,酶免疫染色法具有特异、快速、简便的特点 。

金标法进行鼠疫F1McAb亚类的鉴定

[目的]对实验室融合成功的6株杂交瘤株分泌的鼠疫F1单克隆抗体进行Ig亚类鉴定,为后面的抗体纯化工作作出准备。[方法]采用胶体金标记法鼠单抗亚型测定试剂盒进行检测。[结果]6株杂交瘤株的亚型分别为IgM、IgG2a、IgG2b、IgG3和两株IgG1,轻链全为к链。[结论]采用金标法进行鼠单抗亚类鉴定,操作简便,结果清晰、稳定,不需特殊设备,值得采用。

反向血凝抑制试验(RIHI)检测鼠疫F1抗体在疫情监测和疫源地调查中的应用

在鼠疫疫情监测和疫源地调查工作中,将鼠疫 Fl 单克隆抗体致敏红细胞 (FlM_cAb-RBC) 用于反向间接血凝抑制试验 (RIHI),以间接血凝试验为对照,检测鼠疫 Fl 抗体,检测结果用 ELISA 和 SPRIA 验证,非鼠疫疫区6种动物血清1375份,RIHI 全部阴性,IHA 出现假阳性反应89份。鼠疫疫区3种动物血清713份,RIHI 检出 Fl 抗体阳性反应72份,未出现假阳性反应,IHA 检出 F1 抗体阳性反应44份,出现假阳性反应21份,几何平均滴度 RlHl 比 IHA 高2^(1.45)。RIHI 的特异性和敏感性均高于 IHA ,且简便、稳定、快速,是取代 IHA 检测鼠疫 Fl 抗体的理想方法。

鼠疫F1单克隆抗体建株过程中的动物免疫

目的探讨在建立抗鼠疫F1抗原的单克隆抗体杂交瘤株的过程中抗原免疫的剂量及免疫方法.方法采用F1抗原常规免疫、改良的F1抗原脾内注射免疫以及EV菌免疫3种方法免疫6～8周龄,体重为10～20g,健康的雌性BALB/c小鼠,并用间接ELISA法检测尾血中的抗体. 结果在常规免疫中,200μg 组和100μg组免疫效果优于50μg组,而200μg组和100μg组免疫效果基本一致;改良的F1抗原脾内注射免疫,血中抗体效价较高;EV菌免疫的效果不理想. 结论用F1抗原常规免疫小鼠,免疫剂量用100μg/只较为合适;若要缩短免疫时间,采用改良的脾内注射免疫法是理想的选择.

鼠疫快速诊断技术及其应用研究

目的寻找和确定引起特异性不足的因素,实施科学的对策加以解决,真正实现鼠疫的快速诊断技术并以此为基础构建新一代的检测技术。方法(1)研制高质量的鼠疫F1抗原的单克隆抗体,考虑到位点问题要求尽可能多的、针对不同位点的高效价瘤株,构建稳定的“抗体源;”(2)利用获得的高效瘤株通过纯系小鼠生产抗体或用无蛋白细胞培基生产抗体;(3)对抗体进行纯化并使其达到“免疫纯水平”并建立提取、纯化工艺,最终建立稳定的低成本的无交叉“抗体源;”(4)纯化抗原至“免疫纯水平”或“电泳纯水平”,建立提取、纯化工艺,最终建立稳定低成本的无交叉“抗原源;”(5)对新一代快速检测技术进行实验室和现场评价,对特异性即实验的准确性做出评价。结果(1)确定了影响鼠疫免疫学诊断技术特别是间接红细胞凝集试验(IHA及R IHA)特异性不足的两大因素:a.技术落后,试验中采用的载体不适导致了相当数量的假性凝集;b.技术方法中使用的抗原、抗体严重不纯,尤其是制备抗体时免疫动物“自身抗体”的掺入是造成交叉反应更重要的因素;(2)研制并开发出分泌抗鼠疫F1单克隆抗体(F1-M cAb)的杂交瘤株164株,并从其中筛选出针对不同位点的高效瘤株6株,经活性鉴定及配对试验形成了4个组合,具高效价和高活性;(3)使用制备电泳技术将鼠疫F1抗原提纯至电泳纯水平;(4)将鼠疫F1-M cAb提纯至免疫纯水平;(5)引进、消化了具有先进水平的胶体金标免疫层析技术;(6)使用电泳纯的鼠疫F1抗原及免疫纯的鼠疫F1-M cAb构建了能自人和动物血液中直接检测鼠疫特异抗体的金标免疫层析技术(G ICA)和能自人和动物脏器或穿剌物中直接检测鼠疫F1抗原或鼠疫病原的反向金标免疫层析技术(RG ICA);(7)由于采用了纯化的抗原、抗体,提高了标记效果,其敏感性超过IHA和R IHA,阳性检出率在排除了假阳性和交叉反应后依然高出血凝约5%左右;(8)上述两项技术实验室内经44株非鼠疫菌抗血清和90株非鼠疫菌交叉测定、中和试验以及蛋白印迹鉴定(W estern b lotting)均证实反应特异,基本消除了传统技术存在的非特异反应;(9)经4省(区)不同宿主动物3 168份(其中血清材料2 265份,脏器材料903份)现场标本验证,与实验室取得了一致的结论。结论胶体金免疫层析测试条较好地解决了特异性之难题,有效地避免了其它病原微生物导致的以及酸、碱和嗜异性凝集素、低温条件等造成的假性凝集,同时也有效地消除了由于抗原、抗体不纯,特别是实验动物自然感染其它病原产生的“自身抗体”导致的交叉反应,该技术操作简便,特别适合现场和边远地区应用,对比传统技术该法不需专业性操作,不需仪器设备,因而乡村医生可自行进行操作并做出诊断。

酶免疫染色技术快速检测鼠疫耶尔森菌

目的研究酶免疫染色技术检测鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的敏感性及特异性,建立鼠疫免疫快速检测技术。方法用酶免疫染色技术对细菌标本和动物标本检测鼠疫菌,动物标本同时用细菌学、RIHA、RGICA和ELISA法平行检测鼠疫菌。结果细菌标本酶免疫染色法检测结果与实际相符,酶免疫染色技术检测鼠疫菌的灵敏性为1 000个/ml;动物标本酶免疫染色法检测鼠疫菌结果和细菌学、RIHA、RGICA和ELISA一致。结论酶免疫染色技术检测鼠疫菌敏感、特异、简便、快速,可用于鼠疫检测工作。

鼠疫反向间接血凝技术在国境卫生检疫工作中的应用研究

采用鼠疫F1单克隆抗体(F1 McAb)致敏红细胞用于反向间接血凝试验(RIHA),检测鼠疫菌及其F1抗原的技术,首次对50,000张进口蒙古旱獭皮进行抽样检验。结果从抽取的501份样品中发现6份阳性皮张,为国境口岸的检疫消毒提供了科学依据。试验证明,此方法操作简便,敏感性高,可在国境卫生检疫工作中用于进口皮张等的鼠疫快速检测。