胶体金免疫层析法快速检测鼠疫耶尔森菌F1抗体

目的建立检测鼠疫耶尔森菌F1抗体的胶体金标记免疫层析方法。方法胶体金标记纯化鼠疫F1抗原,双抗原夹心法原理制成免疫层析检测试纸条,并对兔、羊、人和黄鼠血清进行检测评价。结果用80份不同动物种属的阴性血清进行检测,未出现非特异性反应,对5份恢复期病人血清、13份免疫兔血清和2份免疫羊血清检测也取得阳性结果,对于8份I HA临界阳性(滴度1∶20)的达乌尔黄鼠血清检出阳性6份。结论建立了可以用于现场快速检测鼠疫F1抗体的胶体金免疫层析方法。

分泌抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体杂交瘤株的建立

目的应用杂交瘤技术,制备分泌抗鼠疫F1抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法用鼠疫菌F1抗原免疫雌性BALB/c小鼠,检测小鼠血清中的F1抗体,选抗体滴度最高的小鼠用于细胞融合,融合前3天F1抗原经腹腔注射加强免疫1次,然后取其脾脏细胞与处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞混合,50%的PEG作为细胞融合剂,HAT培养液选择培养融合后的细胞,间接ELISA法检测细胞培养上清中的F1抗体,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆及再克隆。结果获得共计100余株分泌F1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,3株进行了4次克隆化,经8个月保存后抗体分泌稳定。结论应用杂交瘤技术,在云南首次成功制备了3株能稳定分泌抗鼠疫杆菌F1抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,建立了杂交瘤技术的实验程序。

鼠疫耶尔森氏菌F1抗原在酿酒酵母中的表达及鉴定

目的:构建含鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1的重组载体,并在酿酒酵母中表达。方法:将鼠疫杆菌的F1抗原结构基因caf1插入到pHSS6mTn3xHA/lacZ质粒中,构建重组载体pHSS6mTn3xHA/lacZcaf1。将重组载体经NotI酶切后,以醋酸锂法转化酿酒酵母,将转化的酿酒酵母接种于SCUra平板上筛选阳性克隆,表达产物用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。结果:经SDSPAGE鉴定和Westernblot分析表明,转化的酿酒酵母可表达鼠疫杆菌F1表面抗原蛋白。结论:成功地构建了重组载体pHSS6mTn3xHA/lacZcaf1,并在酿酒酵母中稳定表达鼠疫杆菌F1表面抗原,为制备可经消化道途径免疫的鼠疫杆菌基因疫苗奠定了基础。

辣根过氧化物酶标记不同表型鼠疫F1单克隆抗体的效果观察

目的观察用辣根过氧化物酶(HRP)标记4种鼠疫F1抗体的效果。方法使用过碘酸钠改良法制备酶结合物,酶标抗体的效价和最适工作浓度用双抗体夹心法测定。结果3株鼠疫F1单克隆抗体中B12标记成功;鼠疫γ球蛋白标记效果较鼠疫F1单克隆抗体B12差。结论过碘酸钠改良法制备辣根过氧化物酶标记鼠疫F1单克隆抗体B12效果优于另外3种鼠疫F1抗体。

鼠疫菌F1抗体/抗原酶联免疫诊断试剂盒的应用评价

目的对兰州生物制品研究所有限责任公司研制的鼠疫菌F1抗体酶联免疫诊断试剂盒和鼠疫菌F1抗原酶联免疫诊断试剂盒进行临床应用评价。方法采用双抗原/抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接血球凝集试验(IHA)、胶体金免疫层析试验(GICA)3种方法的诊断试剂对比检测云南省地方病防治所中心实验室保藏的和现场采集的血清样品和脏器样品,对血清样品做鼠疫菌F1抗体检测,对脏器样品做鼠疫菌F1抗原检测。结果在358份血清样品中,ELISA试剂检出F1抗体阳性52份(14.52%),IHA试剂检出阳性37份(10.34%),GICA试剂检出阳性45份(12.57%)。ELISA与IHA试剂的符合率为95.23%,与GICA试剂的符合率为96.92%。经统计学χ2检验,ELISA试剂检出F1抗体阳性率高于IHA试剂(χ2=11.53,P=0.000 7),与GICA试剂检出的差异无统计学意义(χ2=3.27,P=0.070 4)。进一步分析滴度差值频数,ELISA试剂检测人血清的敏感性高于IHA试剂的样品占87.5%。在117份脏器样品中,3种试剂均检出F1抗原阳性15份(12.82%),符合率100%。滴度差值频数比较,ELISA试剂检测敏感性高于反向间接血球凝集试验(RIHA)试剂的样品为78.57%。结论兰州生物制品研究所有限责任公司研制的鼠疫菌F1抗体酶联免疫诊断试剂盒和鼠疫菌F1抗原酶联免疫诊断试剂盒性质特异,其敏感性优于IHA试剂盒和GICA试剂条,值得在鼠疫的监测和快速诊断中推广应用。

鼠疫菌重组质粒pcDNATE/F1-V的构建及其免疫效果的研究

目的获得含有鼠疫F1和V抗原编码基因的重组质粒pcDNATE/F1-V,并测定其诱导特异性免疫应答的能力。方法PCR扩增鼠疫菌F1和V编码基因,分别与pGEM-T连接测序,构建pcDNATE/F1-V融合重组质粒,转染COS-7细胞,用Westernblot方法鉴定目的蛋白的表达,重组质粒pcDNATE/F1-V加集落刺激因子(GM-CSF)免疫Balb/c小鼠,观察免疫效果。结果pcDNATE/F1-V在COS-7细胞中表达,免疫鼠体内产生特异性抗体,抗体亚型分析、细胞因子等指标的测定结果表明所构建DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主。结论成功构建重组真核表达质粒pcDNATE/F1-V,其具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础。

人tPA信号肽和Yersinia pestis保护性抗原F1-V融合基因的构建及其免疫效果观察

为获得含有鼠疫F1和V抗原编码基因,以及人tPA信号肽基因的重组质粒tPA-pVAX1/F1-V,测定其诱导特异性免疫应答的能力,用PCR扩增鼠疫菌F1和V编码基因,分别与pGEM-T连接测序.构建pVAX1/F1-V融合重组质粒,PCR扩增tPA信号肽片段,并将其插入到F1-V的上游,构建tPA-pVAX1/F1-V融合重组质粒;转染COS-7细胞,Western印迹法鉴定目的蛋白的表达,重组质粒tPA-pVAX1/F1-V加GM-CSF佐剂免疫BALB/c小鼠,观察免疫效果.400个LD50强毒鼠疫菌皮下攻毒观察保护率.结果表明,tPA-pVAX1/F1-V在COS-7细胞中表达;免疫鼠体内产生特异性抗体;抗体亚型分析、细胞因子等指标的测定表明,所构建DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主;(攻毒保护率达90%.结果提示,已成功构建F1-V融合蛋白真核表达载体tPA-pVAX1/F1-V,它具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,对强毒鼠疫菌皮下攻毒有一定的保护效力,为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础.

预测鼠疫耶尔森氏菌F1抗原的CTL表位

目的预测鼠疫菌F1抗原的CTL表位,为鼠疫菌表位疫苗研究奠定基础,并为绘制鼠疫菌抗原表位图谱提供一种可行的研究手段。方法采用nHLAPred网络预测法对F1抗原的CTL表位进行预测。结果预测得到了鼠疫菌F1抗原的特异性CTL优势表位:120～128 SPKVNGENL和153～161 KLAAGKYTD。结论利用nHLAPred法,并结合其他T细胞表位预测方法,可得到抗原的CTL表位,准确率较高,可作为表位图谱绘制的有效工具。

鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原的制备及其免疫保护效果的研究

为制备鼠疫耶尔森氏菌F1-V重组融合蛋白抗原,观察其免疫原性和免疫保护效果,通过疏水层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析纯化鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原.用氢氧化铝凝胶吸附制备试验性鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原,皮下接种健康BALB/c小鼠,ELISA检测血清F1-V抗体效价、MTT法测定淋巴细胞增殖能力,进一步用400LD50鼠疫耶尔森氏菌141标准毒株皮下攻毒,观察动物的存活情况.通过三步柱层析纯化获得的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原纯度达到90%以上.氢氧化铝凝胶吸附的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠三次,血清抗F1-V抗体效价为1∶(51200±800),对耶尔森氏菌141强毒株攻击的保护率是90%.上述结果表明,制备的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原具有良好的免疫原性和免疫保护效果,为研制鼠疫F1-V重组融合蛋白疫苗奠定了基础.

HRP-F1McAb酶免疫染色技术检测小鼠脏器鼠疫F1抗原应用效果评价

目的评价辣根过氧化酶标记鼠疫F1单克隆抗体(HRP-F1McAb)酶免疫染色技术检测小鼠脏器鼠疫F1抗原的应用效果。方法通过HRP-F1McAb酶免疫染色法检测鼠疫菌EV株感染小鼠脏器标本和对照小鼠脏器标本,同时用细菌学、RIHA和ELISA做平行检测。结果 HRP-F1McAb酶免疫染色法与细菌学一致率为96.36%,阳性检出率差异无统计学意义(χ^(2=0),P>0.05);HRP-F1McAb酶免疫染色法和RIHA一致率为98.18%,阳性检出率差异无统计学意义(χ^(2=0),P>0.05);HRP-F1McAb酶免疫染色法和ELISA一致率为96.36%,阳性检出率差异无统计学意义(χ^(2=0),P>0.05)。结论酶免疫染色法检测小鼠脏器鼠疫F1抗原特异敏感、简单快速。

重组鼠疫菌F1抗原在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析

利用基因重组技术,用pET42(b+)质粒在大肠杆菌DE3中表达鼠疫菌F1抗原。经分析rF1抗原基因序列与天然F1抗原结构基因序列完全一致,电泳扫描测其表达量为25%:W estern B lot结果表明,rF1抗原可与F1特异性抗体相互作用,具有天然F1抗原的活性。用镍离子亲和层析纯化rF1抗原免疫BALB/c小鼠,在其血清中可检测到高滴度的抗F1抗体。

鼠疫F1单克隆抗体建株过程中的动物免疫

目的探讨在建立抗鼠疫F1抗原的单克隆抗体杂交瘤株的过程中抗原免疫的剂量及免疫方法.方法采用F1抗原常规免疫、改良的F1抗原脾内注射免疫以及EV菌免疫3种方法免疫6～8周龄,体重为10～20g,健康的雌性BALB/c小鼠,并用间接ELISA法检测尾血中的抗体. 结果在常规免疫中,200μg 组和100μg组免疫效果优于50μg组,而200μg组和100μg组免疫效果基本一致;改良的F1抗原脾内注射免疫,血中抗体效价较高;EV菌免疫的效果不理想. 结论用F1抗原常规免疫小鼠,免疫剂量用100μg/只较为合适;若要缩短免疫时间,采用改良的脾内注射免疫法是理想的选择.

鸭疫里默氏杆菌ATP合成酶F1亚单位α亚基的部分生物学特性研究

为筛选和鉴定鸭疫里默氏杆菌(RA)的感染相关蛋白,本研究采用血清1型RA CH3株活菌和灭活菌体免疫鸭的阳性血清分别与血清2型Th4株的全菌蛋白进行交叉免疫蛋白质组学分析,结果表明ATP合成酶F1亚单位α亚基(ATP-F1-α)、Gro EL蛋白和TPR repeat-containing protein等的抗体仅存在于活菌免疫鸭的血清中,推测其可能为感染相关的交叉性抗原;而Tbd R1的抗体在活菌和灭活菌免疫鸭的血清中均存在。利用自杀质粒同源重组的方法构建了ATP-F1-α的基因缺失株,并将其与野生株CH3的生长曲线进行比较。结果表明,缺失株菌体形态与野生株相似,但其在TSB培养基中的生长几乎停滞。以上结果表明RA ATP-F1-α既是一种交叉抗原,又与细菌的生长相关。

鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1在酿酒酵母中的同源重组及初步鉴定

目的研究新型的防治鼠疫的基因疫苗。方法将鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1构建至pHSS6mTn3xHA/lacZ转座文库质粒中,将此重组质粒经NotI酶切线性化,然后以醋酸锂法转化至酵母细胞中进行同源重组,再以尿嘧啶缺陷型培养基对阳性转化子进行筛选。结果转化子经菌落PCR方法分析鉴定,证明其为重组阳性转化子。结论以同源重组方式构建酿酒酵母表达系统,用以表达鼠疫杆菌F1表面抗原,为经消化道途径实现对鼠疫的基因防治创造条件。

鼠疫耶尔森菌F1-V融合蛋白改构体的构建、原核表达及纯化

目的：通过基于结构的基因突变获得鼠疫耶尔森菌F1抗原突变体（F1mut）,克隆、表达并纯化F1mut-V融合蛋白。方法：通过3轮PCR,将编码F1抗原分子N端1~14位氨基酸的基因序列移到3＇端,测序无误后将F1mut基因与V基因的5＇端连接,构建改构的融合基因F1mut-V,将其克隆到原核表达载体p ET-32a后转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后,目的蛋白为可溶性表达,通过硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析、疏水相互作用层析和凝胶过滤层析纯化,用SDS-PAGE和Western印迹分析纯化产物。结果：重组F1mut-V在大肠杆菌中为可溶性表达,表达量占全菌蛋白的25%以上,纯化后目的蛋白的纯度达95%,经Western印迹检测,与抗V、F1抗体均有特异性结合。结论：重组F1mut-V有望成为新一代亚单位疫苗的有效成分。

土壤保存鼠疫菌F1抗原的试验研究

本文报告利用放射免疫沉淀试验的竞争抑制原理,成功地从实验室保存了五年鼠疫菌的土壤中,检出F1抗原。检出F1抗原量可达340ng/ml。结果表明,该项试验较反向血凝方法敏感。

犬瘟热病毒F1蛋白的原核表达及其抗原性分析

为表达和鉴定犬瘟热病毒(CDV)F1蛋白,本研究通过RT-PCR扩增了CDV HLJ2-07株F1基因,并将其克隆至pET-30a(+)载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下获得大小约为47.5ku以包涵体形式表达的F1重组蛋白,重组蛋白占菌体总蛋白31.5%。Western blot分析表明,表达产物能够被兔抗CDV阳性血清所识别,具有良好的抗原性。间接ELISA检测表明,重组蛋白与犬细小病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒及犬波特氏杆菌等疾病的阳性血清无交叉反应。本研究为进一步建立检测CDV抗体间接ELISA方法及研制F1蛋白亚单位疫苗奠定了基础。

抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体对小鼠的被动免疫保护作用

目的研究抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体(单抗)被动免疫BALB/c小鼠后的抗鼠疫保护效果,确认鼠疫抗体治疗依据,探索鼠疫免疫学治疗的评价手段。方法将BALB/c小鼠随机分组,用不同剂量的抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单抗4C6和2D2分别进行免疫,再分别用不同剂量的鼠疫强毒菌攻击,通过小鼠的存活率和存活时间,判定F1单抗免疫小鼠被动保护其抵抗鼠疫强毒菌攻击的有效性和剂量相关性。结果在14 d的观察期内,在100.0 MLD鼠疫强毒菌攻击下,4C6单抗400.0μg组、200.0μg组、100.0μg组、50.0μg组和25.0μg组小鼠的存活率分别为100%、83%、50%、50%和0%,平均存活时间分别为15.00 d、14.67 d、13.00 d、13.50 d和9.67 d;2D2单抗400.0μg组、200.0μg组、100.0μg组、50.0μg组、25.0μg组小鼠的存活率分别为83%、50%、50%、33%和0%,平均存活时间分别为14.83 d、13.33 d、12.67 d、12.33 d和8.00 d。在10.0 MLD鼠疫强毒菌攻击下,4C6单抗50.0μg组、25.0μg组和12.5μg组小鼠的存活率分别为83%、83%和17%,平均存活时间分别为14.17 d、14.50 d、9.83 d;2D2单抗50.0μg组、25.0μg组、12.5μg组小鼠的存活率分别为100%、33%和33%,平均存活时间分别为15.00 d、12.33d和11.67 d。2.0 MLD和1.0 MLD攻击的未免疫对照组小鼠全部死亡,平均存活时间分别为6.1 d和6.7 d。F1抗原单抗的免疫剂量与小鼠的平均存活时间和存活率有比较明显的相关性(P<0.05)。结论用抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单抗被动免疫小鼠,在受到鼠疫强毒菌攻击时,对小鼠具有免疫保护作用。

应用噬菌体随机肽库技术筛选鼠疫耶尔森菌F1抗原中和性表位

目的:筛选鼠疫耶尔森菌F1抗原的中和性表位,构建基于鞭毛蛋白佐剂的重组表位疫苗。方法:利用鼠疫菌F1抗原的中和抗体F2H5筛选噬菌体随机12肽库,对得到的阳性克隆采用ELISA进行特异性鉴定,采用竞争抑制ELISA确定具有竞争性的噬菌体单克隆并对其DNA测序,重组表达并纯化获得肽序列与截短型鞭毛蛋白Fli Cdel的融合蛋白,并通过Western印迹和ELISA鉴定重组蛋白与F2H5的结合。结果:获得了2株能够与F1抗原竞争结合F2H5的噬菌体单克隆12-1和12-14,其中12-14的竞争能力较强;通过序列比对,并没有发现这2株噬菌体克隆的插入肽序列与F1抗原序列存在一致性,但这2个插入肽序列与Fli Cdel的重组蛋白在Western印迹和ELISA结果中均显示出能够被抗F1的单克隆抗体识别。结论:F1中和性抗体筛选出的肽序列与截短的鞭毛蛋白融合表达后能够被F2H5特异性识别,为进一步对重组表位抗原进行免疫保护评价奠定了基础。

表达鼠疫菌F1抗原的重组芽孢的制备及口服免疫效果观察

目的利用枯草杆菌芽孢展示外源蛋白的呈递技术,研究表面展示鼠疫菌保守抗原F1蛋白的重组芽孢,分析评价重组芽孢的免疫原性。方法将枯草杆菌CotB基因构建到pDG1664质粒,再将鼠疫菌保守序列F1蛋白编码基因连接到CotB基因的下游,构建成重组质粒。然后将外源基因CotB-F1同源重组整合到PY-79枯草杆菌基因组中。经PCR、WesternBlot方法鉴定重组芽孢中鼠疫F1蛋白的表达。用上述重组芽孢以无佐剂口服方式免疫小鼠。采用ELISA方法检测重组芽孢免疫小鼠的免疫效果。结果本研究制备出表面表达CotB-F1融合蛋白的重组枯草杆菌芽孢。用重组芽孢和野生型芽孢口服免疫BALB/c小鼠。实验结果表明,重组芽孢免疫组产生了针对鼠疫F1抗原的特异性抗体。重组芽孢免疫小鼠能产生有效的免疫应答。结论本研究制备出表面展示鼠疫F1蛋白的枯草杆菌芽孢,建立了枯草杆菌芽孢呈递技术方法,为发展口服鼠疫疫苗奠定了基础。