鼠疫F1-V融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达及鉴定

目的通过构建pET-11c-F1-V融合表达质粒,从而获得具有免疫原性的融合蛋白。方法克隆鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)的F1基因和V基因,然后将F1基因和V基因分别连接到pGEM-T载体上,经测序正确后再将F1基因和V基因连接到pET-11c原核表达载体上,构建pET-11c-F1-V融合表达质粒,并转化到BL21(DE3)大肠杆菌中,进行PCR及双酶切鉴定,筛选阳性克隆,通过IPTG诱导F1-V表达,经SDS-PAGE检测表达产物,通过Western-Blot检测重组蛋白的免疫原性。结果测序结果显示F1基因的碱基序列与Gene-bank(X 61996)完全一致,V基因的碱基序列与Gene-bank(M 26405)相比在564 bp处有一同义突变;SDS-PAGE在Mr约58 000处出现一条蛋白条带,经薄层扫描分析目的蛋白条带约占全菌体蛋白的25％左右,主要以可溶性蛋白形式存在;Western-Blot显示重组蛋白具有免疫原性。结论成功地构建了pET-11c-F1-V融合表达质粒,并且在大肠杆菌中获得了高效表达,表达的蛋白具有免疫原性。

犬瘟热病毒F1基因的原核表达与初步应用

将犬瘟热病毒(CDV)F1基因定向克隆入pET-28a(+)载体,构建了原核表达质粒pET-28F1。pET-28F1转化宿主菌BL21(DE3)plysS,在IPTG的诱导下,可高效表达目的基因,表达量达菌体蛋白总量的23.52%。Westernblot分析表明,所表达蛋白能与抗CDV阳性血清发生特异性的抗原-抗体反应。以E.coli表达的CDVF1蛋白为抗原,HRP标记的兔抗犬IgG为二抗,建立了检测抗CDV抗体的间接ELISA方法。试验表明,应用CDVF1蛋白作为抗原检测抗CDV抗体具有特异性高、抗原易纯化、成本低等特点。

犬瘟热病毒水貂分离株F1基因的克隆表达

本研究旨在利用基因工程的方法,制备犬瘟热(canine distemper,CD)疾病诊断用抗原。提取犬瘟热病毒基因组,RT-PCR扩增犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)F1基因序列,克隆并测序。将F1基因定向克隆到原核表达载体pET28a多克隆位点,阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达产物,并用Ni柱亲和层析纯化目的蛋白。结果显示表达的F1重组蛋白能与犬瘟热标准阳性血清发生反应,具有良好的反应原性,可以作为犬瘟热疾病的诊断用抗原。

FAdV-4 NP株F1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

根据FAdV-4 NP株F1蛋白编码框的主要抗原位点,设计一对特异性引物,经PCR扩增、测序,分析表达效率后,进行密码子优化,以合成的新序列作为模板,构建重组表达质粒pET-32a-F1,将质粒转化到BL21中,筛选诱导条件,Western blot鉴定表达产物,将待纯化蛋白依次经过不同浓度的咪唑洗脱,纯化重组蛋白,最后将纯化后的蛋白免疫新西兰黄兔,收集血清并用间接ELISA法测定抗体效价.结果表明,所设计的特异性引物扩增了一条约699 bp的片段.PCR验证和酶切鉴定表明,pET-32a-F1被成功构建,并能够高效表达.重组质粒pET-32a-F1诱导的最佳IPTG浓度为0.3 mmol·??L^-1,最佳诱导时间为5 h,最佳诱导温度为37℃,咪唑洗脱浓度为80 mmol·??L^-1时,能获得较单一的洗脱蛋白.此外,本试验制备的F1多克隆抗体的效价可达1∶1 024 000.

藏鸡POU1F1基因的克隆测序及生物信息学分析

为研究青藏高原特有鸡种,藏鸡的生物学特性,从藏鸡垂体组织的RNA中克隆POU1F1基因,并利用生物信息学对其进行分析.结果显示,藏鸡POU1F1基因开放阅读框(ORF)长为984bp,编码327个氨基酸.编码序列中有13个丝氨酸(Ser)、2个酪氨酸(Tyr)、6个苏氨酸(Thr)磷酸化位点;1个N糖基化位点;二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成;藏鸡POU1F1氨基酸序列与红色原鸡POU1F1氨基酸序列的亲缘关系最近.藏鸡POU1F1基因氨基酸序列可能与藏鸡生长速度慢的特性相关.这一研究结果为今后的藏鸡育种工作提供重要的靶点和参考.

慢病毒载体介导CDK2基因沉默对黑素瘤B16-F1细胞生物学行为的影响

目的:探讨由慢病毒载体p UL介导的p UL-CDK2-shRNA3(CDK2-shRNA)沉默CDK2基因后对小鼠黑素瘤B16-F1细胞恶性生物学行为的影响,初步探索其作用机制。方法:利用重组慢病毒载体CDK2-shRNA转染B16-F1细胞,MTT法检测其对细胞增殖的影响,DAPI染色、Annexin V-FITC/PI双染流式术检测细胞凋亡情况,流式术检测细胞周期变化,细胞黏附实验、transwell小室实验分别检测细胞黏附、侵袭和迁移能力变化,Western blotting检测细胞周期信号通路上RB蛋白(成视网膜细胞瘤蛋白)、pRB蛋白、细胞周期相关转录因子E2F1及侵袭迁移相关蛋白基质金属酶-2(MMP-2)、基质金属酶-9(MMP-9)的表达水平。结果:与空白对照组和阴性对照组相比,CDK2-shRNA组细胞相对增殖率、细胞黏附率、细胞侵袭和迁移能力均显著下降(均P<0.05)。细胞凋亡率显著增加(均P<0.05);G1期细胞显著增加而S期和G2期显著降低(P<0.05)。细胞周期相关蛋白pRB、E2F1明显降低而RB显著升高(P<0.05),细胞侵袭和迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9明显降低(P<0.05)。结论:慢病毒载体p UL介导的shRNA沉默CDK2基因对B16-F1细胞恶性生物学行为有显著的抑制作用,其机制主要与细胞周期和细胞侵袭迁移相关蛋白表达变化有关。

中国荷斯坦牛POU1F1基因第6外显子多态性与产奶性能相关研究

牛POU1F1蛋白对牛乳腺发育有重要作用。哺乳动物上已有很多关于POU1F1基因的研究,但未见该基因对中国荷斯坦牛产奶性能影响的相关报道。作者采用PCR-RFLP技术对182头中国荷斯坦牛POU1F1基因第6外显子的A/G变异进行分析,得到AA、AG和GG基因型频率分别为0.434、0.451和0.115。2χ检验后显示,样本群体符合哈迪-温伯格平衡状态。利用POPgene32软件进行分析表明,该位点多态信息含量属于中度多态。应用SAS 8.1软件的GLM程序进行POU1F1多态性与产奶性状(包括90 d和305 d产奶量、乳脂率、乳蛋白率)关联分析,结果显示GG基因型牛与AA和AG型牛相比,有更高的乳蛋白率(P<0.05);而该位点对乳脂率和产奶量影响不显著(P>0.05)。因此,POU1F1基因的SNP初步可以作为影响中国荷斯坦牛乳蛋白率的实践依据。

鱼类性别相关基因FTZ-F1的研究进展

FTZ-F1基因属于孤核受体超家族成员,最初是在果蝇(Drosophila)中发现的,该基因在果蝇胚胎发生的早期调控体节分化基因ftshi-tarazu(FTZ)表达。目前已经发现了很多它的同源基因。研究证明它在类固醇生成、性别分化过程中都发挥着重要的作用。鱼类在脊椎动物系统进化中处于承前启后的地位,是脊椎动物中分布最广、种类最多的类群,具有多种多样的生物学特征和重大的经济价值,所以对于鱼类性别决定机理的研究具有重大意义。文章就鱼类中发现的性别相关基因FTZ-F1,及该基因在胚胎发育过程中的作用、在性逆转鱼中的作用及与芳香化酶的相互作用关系等进行了综述,旨在为系统研究鱼类性别决定机制提供参考。

新城疫病毒F48E9株F1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F48E9株F1基因序列和原核表达载体pET-28a的克隆位点,设计1对引物,通过PCR方法获得了F1基因;将F1双酶切产物插入原核表达载体pET-28a,得到的重组子命名为pET-F1。用IPTG进行诱导将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,NDV F1在pET-F1中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为31 ku。表达的重组蛋白为进一步研究NDV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。

粉尘螨主要变应原基因Der f1和Der f3改组的研究

目的:探索粉尘螨变应原基因Der f1和Der f3改组条件,以期获得粉尘螨变应原融合突变基因。方法:RT-PCR方法扩增粉尘螨变应原Der f 1和Der f3基因,用DnaseⅠ分别酶解Der f 1和Der f3基因10、15、20、25、30 min;酶解相同时间的Der f1和Der f3基因片段两两混合,采用DNAshuffling技术对粉尘螨变应原Der f1和Der f3基因进行重组,琼脂糖凝胶电泳检测重组子。结果:以Der f 2 F和Der f2 R为引物在酶切10、15、20、25、30min均可扩增出清晰条带;以Der f1 F和Der f1 R、Der f1 F和Der f2 R、Der f2 F和Der f1 R为引物在酶切10、15、20、25、30min的模板中均无条带出现;而其他引物组合则在不同酶切时间的模板中均出现条带。结论:通过多种条件的组合,可获得多个粉尘螨变应原基因Der f1和Der f3间的融合基因,为大规模制备高效、低价的哮喘疫苗奠定了基础。

三疣梭子蟹ftz-f1基因的克隆及相关核受体基因在蜕皮中的功能分析

采用RACE技术克隆三疣梭子蟹核受体fzt-f1基因,全长c DNA序列1763bp。该基因3′和5′非编码区分别为1034bp和141bp,开放阅读框为588bp,推测编码195个氨基酸,预测分子量为22.8k Da,理论等电点为6.35,命名为PTNHr基因。同源性和系统进化分析表明,三疣梭子蟹fzt-f1基因与刀额新对虾同源性高达75.4%,并且与刀额新对虾聚为一支。对核受体基因fzt-f1、Ec R和RXR在蜕皮周期中的表达情况进行实时荧光定量PCR分析,结果表明,三个核受体基因在不同蜕皮时期,均出现表达差异,说明这三个基因都参与蜕皮调控过程。其中,fzt-f1和RXR基因在不同蜕皮时期的表达模式上出现相反的表达特征,预测这两个基因存在相互抑制的调节关系。Ec R和RXR基因在不同蜕皮时期的表达模式上出现部分相似的表达特征。

滩寒杂交F1代BMP15和GDF9基因多态性及不同基因型对繁殖性状影响的研究

为了研究绵羊高繁殖力候选基因骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15, BMP15)基因和生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)基因的多态性及不同基因型对滩寒杂交F1代群体繁殖性状的影响,试验以采集的915份滩寒杂交F1代群体血液样本为研究对象,采用飞行时间质谱基因分型技术进行SNP位点分型和遗传多态性分析,并利用Sanger测序技术进行验证,然后对不同基因型与滩寒杂交F1代群体繁殖性状和泌乳性状分别进行关联分析。结果表明:BMP15和GDF9基因SNP位点在915份DNA样本中均呈集中聚类分布。滩寒杂交F1代群体BMP15和GDF9基因均存在AA、AB、BB 3种基因型,其中BMP15基因在滩寒杂交F1代群体中的优势等位基因为A基因,基因型频率为0.69;GDF9基因在滩寒杂交F1代群体中的优势等位基因为A基因,基因型频率为0.58。BMP15和GDF9基因SNP位点在滩寒杂交F1代群体中均处于中度多态,GDF9基因处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。BMP15和GDF9基因AA基因型在滩寒杂交F1代群体中的产羔数均高于AB和BB基因型,其中BMP15基因AA和BB基因型第2胎次产羔数显著高于AB基因型(P<0.05),AA基因型第3胎次产羔数显著高于AB和BB基因型(P<0.05);GDF9基因型AA和AB基因型第1胎次产羔数显著高于BB基因型(P<0.05)。滩寒杂交F1代BMP15基因AA基因型有421只,GDF9基因AA基因型有315只泌乳周期为>90 d~<150 d,经计算占比均高于50%,并且与AB、BB基因型比较均差异显著(P<0.05)。说明BMP15和GDF9基因的多态位点与AA基因型有可能成为提高滩寒杂交群体繁殖性状的分子标记。

POU1 F1基因多态性与南方荷斯坦牛产奶量的相关性分析

采用PCR-RFLP技术研究了364头荷斯坦牛POU1 F1基因第二外显子的TaqⅠ酶切位点(e2-TaqⅠ)和第六外显子的HinfⅠ酶切位点(e6-HinfⅠ)多态性,并分析了两个位点多态性与泌乳量的关系。结果表明,实验群体中这两个多态位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态,e2-TaqⅠ位点等位基因G/A的频率为0.2706/0.7294,e6-HinfⅠ位点等位基因G/A频率为0.3228/0.6772。性状关联结果表明,两个位点的基因型与第一、二胎泌乳量相关性不明显。

壬基酚对大鼠F1子代脑基因表达的影响

目的:研究壬基酚通过妊娠期暴露是否会影响F1子代的脑发育。方法:对SD孕鼠染毒NP,从妊娠第7天开始持续到产后第二天,分别提取NP组和对照组F1代2d龄大鼠的脑组织mRNA,表达谱基因芯片检测脑基因的表达。用Q-PCR法验证F1雄性子代大脑泛素特异性蛋白酶8、ATP结合盒转运子和内磺肽蛋白这三个下调基因的表达,然后用Western blotting法检测F1子代大脑泛素特异性蛋白酶8的蛋白表达。结果:ATP结合盒转运子(ATP-binding cassette,ABCA)、内璜肽蛋白(Endosulfine alph,Ensa)、泛素特异性蛋白酶8(Ubiquitin Specific Protease 8,USP8/UBPy)基因和蛋白表达下调。结论:NP可影响神经细胞的正常结构和信号转导功能,并提示可以干扰机体内分泌系统、脂质和能量代谢及一系列正常生理功能。

牛、羊POU1F1基因的研究进展

POU1F1基因是POU基因家族的重要成员。POU1F1蛋白在哺乳动物胚胎分化和生长发育过程中起着关键作用。本文综述POU1F1基因的结构特征与功能,POU1F1蛋白的结构特征与作用方式,POU1F1蛋白的调控机制以及近年来对牛、羊POU1F1基因遗传变异及其与经济性状关系研究的最新进展。

饲粮能量水平对白萨福克×湖羊F1羔羊生产性能和脂肪代谢相关基因表达的影响

该试验旨在研究饲粮能量水平对萨湖F1代羔羊生产性能、血清生化指标及脂肪相关基因表达的影响。选取2月龄左右、健康、体重为20.45±1.52 kg白萨福克×湖羊F1代羔羊36只,随机分3个处理组(每组4个重复,每个重复3只羊)分别饲喂消化能为8.67 MJ/kg(LE)、10.38 MJ/kg(CON)和12.31 MJ/kg(HE),蛋白水平均为14.36%的试验饲粮,预试期8 d,正试期70 d。试验期间测定羔羊生长性能,饲养试验结束后所有羊颈静脉采血,并于每个重复随机选取1只羔羊屠宰,测定屠宰性能和肉质性状、血清生化指标及脂肪相关基因的表达。结果表明,低饲粮能量水平(8.67 MJ/kg)可显著降低羔羊的末重、平均日增重和宰前活重,并显著升高料肉比(P<0.05);随着饲粮能量水平的升高,HE组的血清总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和总蛋白水平显著高于CON组和LE组(P<0.05)。HE组的甘油三酯水平显著高于CON组和LE组(P<0.05);饲粮能量水平增加会显著提高皮下脂中ACC、HSL,尾脂中ACC、FASN和背最长肌中FABP4基因mRNA的表达量(P<0.05),显著降低尾脂中HSL和背最长肌中ACC、PPARγ、HSL基因mRNA的表达量(P<0.05)。饲粮能量水平过高或过低均会抑制皮下脂和尾脂的FABP4与背最长肌中FASN mRNA的表达,CON组表达水平最高(P<0.05)。综合生产性能、血清生化指标和脂肪代谢基因的表达得出,饲粮消化能水平为12.31 MJ/kg时更适用于2~4月龄白萨湖F1代羔羊的生长发育和体脂沉积。

肾透明细胞癌中X染色体生殖同源盆基因F1(Rhox F1)表达及其甲基化状态研究

目的:探讨人肾透明细胞癌组织中X染色体生殖同源盒基因F1(Rhox F1)启动子CpG岛甲基化及其mRNA表达情况,分析MTHFR C677T不同基因型Rhox F1甲基化及mRNA的表达情况。方法:收集我院手术切除的38例肾透明细胞癌组织(肾癌组)及其配对的癌旁正常肾脏组织区(正常组)标本。采用实时PCR和甲基化特异PCR(MSP)技术分别检测肾癌组和正常组的Rhox F1 mRNA的表达和甲基化状态。采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术分别检测MTHFR基因677(C→T)多态性,分析MTHFR C677T不同基因型Rhox F1启动子去甲基化率及mRNA表达情况。结果:正常组中Rhox F1基因mRNA阳性表达率36.8%明显低于肾癌组的89.5%,差异有统计学意义(χ~2=22.619,P<0.001)。正常组中Rhox F1基因启动子甲基化率为78.9%,显著高于肾癌组的18.4%(χ~2=27.861,P<0.001)。34例Rhox F1 mRNA阳性表达的肾癌组织[MTHFR 677(C→T)]中TT基因型患者25例,CT基因型患者5例,CC基因型患者4例,Rhox F1 mRNA表达水平差异具有统计学意义(F=80.201,P<0.001),且TT基因Rhox F1 mRNA表达水平(0.91±0.01)显著高于CT基因型(0.33±0.03)和CC基因型(0.26±0.03),差异均有统计学意义(均P<0.001)。TT基因型中有24例Rhox F1启动子去甲基化(96.0%);CT基因型中有2例(40.0%);CC基因型中有1例(25.0%)。TT、CT、CC三组基因Rhox F1启动子去甲基化率差异具有统计学意义(P<0.001),其中TT基因Rhox F1启动子去甲基化率显著高于CT基因型和CC基因型(P=0.009,P=0.004)。结论:Rhox F1 mRNA在肾癌组织中高表达,Rhox F1启动子去甲基化率在肾癌组织中较高。MTHFR基因677(C→T)中TT基因型肾癌患者Rhox F1 mRNA表达水平和启动子去甲基化阳性率高于CT和CC基因型。

鼠疫耶尔森菌的多重PCR检测方法

目的研究一种快速、特异的检测鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的多重聚合酶链反应(PCR)方法。方法选用针对鼠疫菌F1抗原基因、pla基因、inv基因和一段鼠疫特异染色体序列设计的4对引物,以鼠疫菌及其他肠道致病菌DNA为模板并加入内部对照模板,在同一扩增体系中进行PCR扩增。结果鼠疫菌DNA模板可扩增出预期产物,而其他菌株只能扩增出内部对照模板的片段。结论多重PCR方法具有较高的特异性。可迅速、有效地将鼠疫菌与其他肠道致病菌相鉴别,也可应用于鼠疫监测。

子一代实验室钉螺细胞色素c氧化酶I、细胞色素b基因序列分析

目的 了解钉螺子一代 (F1)实验室钉螺群 (湖北钉螺湖北亚种 )内的遗传变异。 方法 实验室饲养的F1钉螺 ,单个抽提基因组DNA ,PCR扩增细胞色素c氧化酶I(COI)、细胞色素b(Cytb)基因并测序 ,用GENETYX MACver .9软件进行同源排序、DNA和氨基酸序列分析 ,同时与GenBank相同基因序列比较。 结果 实验室螺群内 ,COI基因差异为 12 .2 % ,94个氨基酸发生变化。Cytb基因差异 6.4% ,有 2 5个氨基酸发生变化。湖北亚种与滇川亚种COI基因序列差异率为 13 .5 %。与GenBank中湖北钉螺滇川亚种Cytb基因序列比较 ,差异为 13 .6% ,在 2 0 3个氨基酸中 6个氨基酸发生变化。 结论 F1实验室钉螺群内核苷酸与氨基酸序列均发生变异。

龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因(mitochondrial F1-ATPase beta subunit gene),并分析该基因在龙眼体胚发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因全长序列;随后通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达规律。【结果】成功克隆龙眼胚性愈伤组织线粒体ATP合酶β亚基基因完整cDNA序列(GenBank登录号:FJ222749),该序列全长2099bp,由1677bp核苷酸组成的ORF,编码558个氨基酸。该基因与其它植物的线粒体ATP合酶β亚基基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面相似性较高。对来源于动、植物的28条线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所构建的进化树分析表明,由线粒体ATP合酶β亚基基因编码区序列所建立的系统关系树与真实的动、植物进化基本一致,龙眼处在双子叶植物中,由于该基因在龙眼同科属的植物中为首次克隆,所以有自己单独的分支。qRT-PCR结果分析表明,随着龙眼体胚的发育,线粒体ATP合酶β亚基基因转录水平逐渐升高,到球形胚阶段达到最高,而后又急剧下降,到鱼雷形胚阶段降到最低,子叶形胚阶段略有升高。【结论】龙眼线粒体ATP合酶β亚基基因与其它植物相应序列具有较高同源性,在龙眼体胚发育过程中,以球形胚阶段的表达最高。