鼠疫F1-V重组蛋白疫苗滴鼻免疫应答效果的研究

目的以重组霍乱毒素B亚单位(rCT-B)为鼠疫F1-V重组蛋白的佐剂制备黏膜疫苗,观察小鼠诱导的黏膜免疫和系统免疫应答效果。方法以制备的鼠疫黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠4次免疫后,采用间接ELISA检测血清特异性抗F1-V的IgG和IgA抗体及抗体亚型分类,检测鼻咽喉、肺、小肠及阴道灌洗液中特异性抗F1-V的黏膜分泌型IgA;采用流式细胞术检测鼻相关淋巴组织淋巴细胞、脾淋巴细胞、肠系膜淋巴结及小肠PP结T淋巴细胞表型的变化。结果以rCT-B为佐剂的鼠疫F1-V重组蛋白黏膜疫苗滴鼻免疫后,能够诱导血清中IgGI、gA抗体比正常对照组显著升高(P<0.01),同时诱导鼻咽、肺、小肠和阴道内特异性黏膜抗体升高,尤其是肺和生殖道冲冼液内抗体升高极为显著(P<0.01)。与单纯的F1-V组相比,不同剂量比例疫苗组都能诱导较高、较快的血清IgGI、gA和黏膜sIgA,其中1∶2疫苗组能诱导更强的系统免疫和黏膜免疫,但是相比之下,5∶1疫苗组是最合适的免疫剂量。结论rCT-B佐剂不仅能提高鼠疫F1-V黏膜疫苗的系统全身免疫应答,还能促进诱导呼吸道、消化道和生殖道等局部黏膜sIgA抗体,增强局部免疫应答,提示rCT-B佐剂能显著提高鼠疫感染的免疫应答作用,这为下一步疫苗的免疫保护评价奠定了基础。

鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原的制备及其免疫保护效果的研究

为制备鼠疫耶尔森氏菌F1-V重组融合蛋白抗原,观察其免疫原性和免疫保护效果,通过疏水层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析纯化鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原.用氢氧化铝凝胶吸附制备试验性鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原,皮下接种健康BALB/c小鼠,ELISA检测血清F1-V抗体效价、MTT法测定淋巴细胞增殖能力,进一步用400LD50鼠疫耶尔森氏菌141标准毒株皮下攻毒,观察动物的存活情况.通过三步柱层析纯化获得的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原纯度达到90%以上.氢氧化铝凝胶吸附的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠三次,血清抗F1-V抗体效价为1∶(51200±800),对耶尔森氏菌141强毒株攻击的保护率是90%.上述结果表明,制备的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原具有良好的免疫原性和免疫保护效果,为研制鼠疫F1-V重组融合蛋白疫苗奠定了基础.

His-tag不影响RSV重组蛋白G1F/M2的免疫原性

目的:观察His-tag是否影响RSV重组蛋白G1F/M2的免疫原性。方法:PCR扩增G1和F/M2基因片段,插入表达载体pET-His和pET-DsbA-His中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni+螯合亲和层析法纯化得His-G1F/M2和DsbA-His-G1F/M2,将后者用凝血酶消化,再经Ni+螯合亲和层析法纯化得G1F/M2,将His-G1F/M2和G1F/M2免疫BALB/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT法测定细胞毒性T细胞活性(CTL)。结果:两种蛋白在BALB/c小鼠中诱导的RSV特异性抗体和CTL活性无显著差异。结论:His-tag不影响RSV重组蛋白G1F/M2的免疫原性。

呼吸道合胞病毒重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法及免疫原性研究

目的建立呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,并研究其免疫原性。方法PCR扩增G1和F/M2基因片段,经酶切后插入原核表达载体pET-DsbA中,构建重组质粒pET-DsbA-G1F/M2,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni+螯合亲和色谱法纯化尿素变性的包涵体溶液,梯度透析复性,Western-blot鉴定重组蛋白的RSV特异性,免疫BALB/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT法测定细胞毒性T细胞活性(CTL)。结果构建的重组质粒在E.coli中表达了RSV特异性的重组蛋白,经变性、纯化并复性后获得了高纯度的DsbA-G1F/M2(>90%);该蛋白诱导了高滴度的RSV特异性抗体和CTL活性。结论建立了重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究开发RSV重组亚单位疫苗奠定了基础。

犬瘟热病毒F1蛋白的原核表达及其抗原性分析

为表达和鉴定犬瘟热病毒(CDV)F1蛋白,本研究通过RT-PCR扩增了CDV HLJ2-07株F1基因,并将其克隆至pET-30a(+)载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下获得大小约为47.5ku以包涵体形式表达的F1重组蛋白,重组蛋白占菌体总蛋白31.5%。Western blot分析表明,表达产物能够被兔抗CDV阳性血清所识别,具有良好的抗原性。间接ELISA检测表明,重组蛋白与犬细小病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒及犬波特氏杆菌等疾病的阳性血清无交叉反应。本研究为进一步建立检测CDV抗体间接ELISA方法及研制F1蛋白亚单位疫苗奠定了基础。

RSV CTL表位与G蛋白片段的融合表达对G蛋白片段诱导的免疫应答的调节作用

目的:观察呼吸道合胞病毒(RSV)的CTL表位F/M2与G蛋白抗原活性片段G1融合表达后,对G1诱导的免疫应答的调节作用。方法:将重组表达质粒pET-DsbA-G1和pET-DsbA-G1F/M2分别转化E.coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白DsbA-G1和DsbA-G1F/M2,亲和层析纯化。取上述蛋白,腹腔注射免疫BALB/c小鼠,定期采集血清和脾细胞,用MTT法测定CTL杀伤活性,ELISA测定IgG及其亚类IgG1和IgG2a抗体滴度,空斑抑制实验检测血清中和抗体。结果:经表达和纯化获得了纯度达90%以上的融合蛋白;DsbA-G1F/M2诱导了显著的RSV特异性CTL杀伤活性,而无CTL表位的DsbA-G1则不能诱导产生CTL反应;DsbA-G1F/M2和DsbA-G1均刺激产生了强烈的IgG抗体应答,但DsbA-G1所产生的IgG亚类仅为IgG1,而DsbA-G1F/M2同时诱导了高滴度的IgG1和IgG2a,显著下调了IgG1与IgG2a的比例;二者均诱导了高滴度的中和抗体,但与DsbA-G1相比,DsbA-G1F/M2所诱导的中和抗体滴度有所减弱。结论:CTL表位F/M2与G蛋白片段G1的融合表达产物DsbA-G1F/M2,能够同时诱导细胞免疫和体液免疫应答,CTL的激活下调了IgG1与IgG2a的比例,使得免疫应答更平衡,有利于改善该候选疫苗的安全性。

中试规模纯化重组鼠疫rF1-V融合蛋白及其免疫原性分析

重组F1-V融合蛋白(rF1-V)是目前在进行临床研究的鼠疫亚单位疫苗的主要成分。本研究摸索了rF1-V的可溶表达条件,并对条件进行了优化和放大,确定的中试发酵工艺为:在重组菌对数生长期中期加入50μmol/LIPTG,25℃诱导表达5h。通过硫酸铵分级沉淀、离子交换、疏水相互作用层析和凝胶过滤四步纯化,最终得到纯度为99%、回收率大于20%且各项检测指标合格的蛋白。在此基础上,将蛋白使用氢氧化铝佐剂进行吸附,在小鼠体内进行了免疫原性研究。ELISA测定两次皮下免疫后血清的抗体滴度。比较融合蛋白免疫组(rF1-V)与单一抗原免疫组(rF1、rV)以及联合抗原免疫组(rF1+rV)之间体液免疫反应的差异。结果显示:20μgrF1-V免疫剂量组诱导的抗F1抗体滴度明显高于其他组,抗V抗体滴度与其他组相比没有显著差异。表明本工艺制备的rF1-V抗原有望作为鼠疫亚单位疫苗的主要组分。

蛋白体佐剂及用于鼠疫F1-V抗原的免疫效果

目的以蛋白体（proteosomes）佐剂，非共价结合鼠疫F1-V重组蛋白为免疫原，探讨滴鼻免疫BALB／c小鼠后诱导的免疫应答和免疫保护效果。方法佐剂与鼠疫F1-V重组蛋白为免疫原非共价结合，滴鼻免疫BALB／c小鼠4次后，采用间接ELISA检测血清特异性抗F1-V的IgG和IgA抗体及抗体亚型分类，并检测鼻咽、肺、小肠及阴道灌洗液中特异性抗F1-V的黏液分泌型IgA；并用流式细胞术检测鼻相关淋巴组织淋巴细胞、脾淋巴细胞、肠系膜淋巴结及小肠PP结T淋巴细胞表型的变化。第4次免疫后7d，用100峨的鼠疫141强毒株进行腹腔攻毒。结果（1）以蛋白体为佐剂的鼠疫F1-V抗原与单纯的F1-V组相比，蛋白体疫苗组诱导血清IgG、IgA抗体显著升高（P〈0．01），同时蛋白体疫苗组能诱导鼻咽、肺、小肠和阴道内多个黏膜部位特异性IgA抗体的产生，尤其是肺和生殖道冲冼液内抗体升高极为显著（P〈0．01）；（2）蛋白体疫苗组主要引起IgG1型抗体，主要诱导TH2型免疫反应；（3）蛋白体疫苗组NALT和SP中CD^4＋/CD^8＋比值比PBS对照有显著增高（P〈0．01），MLN和PP中CD^4＋／CD^8＋比值与PBS对照差异无统计学意义（P〉0．05）。（4）小鼠100 LD50的鼠疫141强毒株腹腔攻毒后鼠疫F1-V重组蛋白组小鼠免疫保护率为0，而蛋白体佐剂疫苗组小鼠免疫保护率为67％。结论以自制的蛋白体为鼠疫F1-V抗原的佐剂滴鼻免疫小鼠，蛋白体不仅提高鼠疫F1-V抗原的系统免疫应答，而且能诱导小鼠呼吸道、消化道和生殖道局部黏膜免疫应答。蛋白体佐剂鼠疫疫苗对100 LD50的鼠疫141强毒株腹腔攻毒具有一定的免疫保护作用，这为鼠疫黏膜疫苗的研制提供候选材料，也为鼠疫黏膜疫苗深入研究奠定了基础。