鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原的制备及其免疫保护效果的研究

为制备鼠疫耶尔森氏菌F1-V重组融合蛋白抗原,观察其免疫原性和免疫保护效果,通过疏水层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析纯化鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原.用氢氧化铝凝胶吸附制备试验性鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原,皮下接种健康BALB/c小鼠,ELISA检测血清F1-V抗体效价、MTT法测定淋巴细胞增殖能力,进一步用400LD50鼠疫耶尔森氏菌141标准毒株皮下攻毒,观察动物的存活情况.通过三步柱层析纯化获得的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原纯度达到90%以上.氢氧化铝凝胶吸附的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠三次,血清抗F1-V抗体效价为1∶(51200±800),对耶尔森氏菌141强毒株攻击的保护率是90%.上述结果表明,制备的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原具有良好的免疫原性和免疫保护效果,为研制鼠疫F1-V重组融合蛋白疫苗奠定了基础.

不同佐剂与鼠疫F1-V融合重组蛋白抗原滴鼻免疫效果的研究

目的研究不同佐剂与鼠疫F1-V融合重组蛋白抗原滴鼻免疫Balb/c小鼠,观察机体产生体液免疫和局部粘膜免疫反应的效果,为发展黏膜疫苗提供理论基础。方法鼠疫F1-V融合重组蛋白抗原按比例分别与PorB(2类外膜蛋白)重组蛋白、蛋白体佐剂制备黏膜疫苗,滴鼻免疫Balb/c小鼠3次,取尾静脉血,采用ELISA检测血清IgG及抗体亚型分类,并检测鼻咽、肺、小肠及阴道灌洗液sIgA;采用FAC检测脾淋巴细胞表型的变化。结果PorB重组蛋白佐剂疫苗组和蛋白体佐剂疫苗组较无佐剂组体液免疫抗体水平高、蛋白体佐剂疫苗组好于PorB重组蛋白佐剂疫苗组,但无显著性差异。结论PorB重组蛋白佐剂疫苗和蛋白体佐剂疫苗均能诱导较强的系统免疫和黏膜免疫应答,且PorB重组蛋白佐剂疫苗免疫效果可与蛋白体佐剂疫苗相媲美,可进一步论证是否可用PorB重组蛋白佐剂替代蛋白体佐剂,这为鼠疫粘膜疫苗的研制奠定了基础。

鼠疫F1-V重组蛋白疫苗滴鼻免疫应答效果的研究

目的以重组霍乱毒素B亚单位(rCT-B)为鼠疫F1-V重组蛋白的佐剂制备黏膜疫苗,观察小鼠诱导的黏膜免疫和系统免疫应答效果。方法以制备的鼠疫黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠4次免疫后,采用间接ELISA检测血清特异性抗F1-V的IgG和IgA抗体及抗体亚型分类,检测鼻咽喉、肺、小肠及阴道灌洗液中特异性抗F1-V的黏膜分泌型IgA;采用流式细胞术检测鼻相关淋巴组织淋巴细胞、脾淋巴细胞、肠系膜淋巴结及小肠PP结T淋巴细胞表型的变化。结果以rCT-B为佐剂的鼠疫F1-V重组蛋白黏膜疫苗滴鼻免疫后,能够诱导血清中IgGI、gA抗体比正常对照组显著升高(P<0.01),同时诱导鼻咽、肺、小肠和阴道内特异性黏膜抗体升高,尤其是肺和生殖道冲冼液内抗体升高极为显著(P<0.01)。与单纯的F1-V组相比,不同剂量比例疫苗组都能诱导较高、较快的血清IgGI、gA和黏膜sIgA,其中1∶2疫苗组能诱导更强的系统免疫和黏膜免疫,但是相比之下,5∶1疫苗组是最合适的免疫剂量。结论rCT-B佐剂不仅能提高鼠疫F1-V黏膜疫苗的系统全身免疫应答,还能促进诱导呼吸道、消化道和生殖道等局部黏膜sIgA抗体,增强局部免疫应答,提示rCT-B佐剂能显著提高鼠疫感染的免疫应答作用,这为下一步疫苗的免疫保护评价奠定了基础。

人tPA信号肽和Yersinia pestis保护性抗原F1-V融合基因的构建及其免疫效果观察

为获得含有鼠疫F1和V抗原编码基因,以及人tPA信号肽基因的重组质粒tPA-pVAX1/F1-V,测定其诱导特异性免疫应答的能力,用PCR扩增鼠疫菌F1和V编码基因,分别与pGEM-T连接测序.构建pVAX1/F1-V融合重组质粒,PCR扩增tPA信号肽片段,并将其插入到F1-V的上游,构建tPA-pVAX1/F1-V融合重组质粒;转染COS-7细胞,Western印迹法鉴定目的蛋白的表达,重组质粒tPA-pVAX1/F1-V加GM-CSF佐剂免疫BALB/c小鼠,观察免疫效果.400个LD50强毒鼠疫菌皮下攻毒观察保护率.结果表明,tPA-pVAX1/F1-V在COS-7细胞中表达;免疫鼠体内产生特异性抗体;抗体亚型分析、细胞因子等指标的测定表明,所构建DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主;(攻毒保护率达90%.结果提示,已成功构建F1-V融合蛋白真核表达载体tPA-pVAX1/F1-V,它具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,对强毒鼠疫菌皮下攻毒有一定的保护效力,为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础.

鼠疫耶尔森菌F1-V融合蛋白改构体的构建、原核表达及纯化

目的：通过基于结构的基因突变获得鼠疫耶尔森菌F1抗原突变体（F1mut）,克隆、表达并纯化F1mut-V融合蛋白。方法：通过3轮PCR,将编码F1抗原分子N端1~14位氨基酸的基因序列移到3＇端,测序无误后将F1mut基因与V基因的5＇端连接,构建改构的融合基因F1mut-V,将其克隆到原核表达载体p ET-32a后转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后,目的蛋白为可溶性表达,通过硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析、疏水相互作用层析和凝胶过滤层析纯化,用SDS-PAGE和Western印迹分析纯化产物。结果：重组F1mut-V在大肠杆菌中为可溶性表达,表达量占全菌蛋白的25%以上,纯化后目的蛋白的纯度达95%,经Western印迹检测,与抗V、F1抗体均有特异性结合。结论：重组F1mut-V有望成为新一代亚单位疫苗的有效成分。

肿瘤相关抗原RCAS1重组质粒的构建与GST-RCAS1融合蛋白的表达和纯化及鉴定

目的:构建RCA S1的重组质粒、表达GST-RCA S1融合蛋白并进行纯化和生物学活性鉴定。方法:从M CF-7细胞提取总RNA,通过RT-PCR得到RCA S1的扩增产物,纯化后用E coRⅠ和BamHⅠ双酶切。选择pGEX-2T作为载体,用E coRⅠ和BamHⅠ双酶切后与上述酶切后DNA连接,转化感受态JM 109大肠杆菌,挑单个菌落提取质粒进行双酶切和测序鉴定。选择测序正确的质粒重新转化BL 21大肠杆菌,用终浓度0.1 mm o l/L的IPTG诱导表达GST-RCA S1蛋白,用GST亲和层析纯化并通过SDS-PAGE电泳和W estern印迹试验证实。利用特异性抗RCA S1多抗(N-18和C-20)鉴定所表达的融合蛋白,通过流式细胞仪检测GST-RCA S1融合蛋白诱导活化T细胞凋亡的作用。结果:通过RT-PCR得到大小为642bp的产物,重组质粒通过双酶切和测序鉴定正确。通过IPTG诱导在BL 21大肠杆菌中表达并纯化得到GST-RCA S1蛋白,通过SDS-PAGE电泳鉴定分子量为52 kM r,与预测一致,并由W estern印迹试验证明为GST融合蛋白。该融合蛋白能被特异性抗RCA S1(N-18和C-20)多抗识别。GST-RCA S1对诱导活化的T细胞凋亡有一定的作用。结论:成功构建RCA S1的重组质粒,并表达GST-RCA S1融合蛋白,对其生物学活性作了初步研究。

鼠疫菌重组质粒pcDNATE/F1-V的构建及其免疫效果的研究

目的获得含有鼠疫F1和V抗原编码基因的重组质粒pcDNATE/F1-V,并测定其诱导特异性免疫应答的能力。方法PCR扩增鼠疫菌F1和V编码基因,分别与pGEM-T连接测序,构建pcDNATE/F1-V融合重组质粒,转染COS-7细胞,用Westernblot方法鉴定目的蛋白的表达,重组质粒pcDNATE/F1-V加集落刺激因子(GM-CSF)免疫Balb/c小鼠,观察免疫效果。结果pcDNATE/F1-V在COS-7细胞中表达,免疫鼠体内产生特异性抗体,抗体亚型分析、细胞因子等指标的测定结果表明所构建DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主。结论成功构建重组真核表达质粒pcDNATE/F1-V,其具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础。

犬瘟热病毒F1蛋白的原核表达及其抗原性分析

为表达和鉴定犬瘟热病毒(CDV)F1蛋白,本研究通过RT-PCR扩增了CDV HLJ2-07株F1基因,并将其克隆至pET-30a(+)载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下获得大小约为47.5ku以包涵体形式表达的F1重组蛋白,重组蛋白占菌体总蛋白31.5%。Western blot分析表明,表达产物能够被兔抗CDV阳性血清所识别,具有良好的抗原性。间接ELISA检测表明,重组蛋白与犬细小病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒及犬波特氏杆菌等疾病的阳性血清无交叉反应。本研究为进一步建立检测CDV抗体间接ELISA方法及研制F1蛋白亚单位疫苗奠定了基础。

重组HIV-1抗原的应用及评价

将纯化的基因重组HIV 1P2 4和融合蛋白P2 4 gp4 1包被微孔板 ,用ELISA分别检测正常人血清和HIV Ab国家参比品 (Panel)。rP2 4对 2 0份HIV Ab阳性Panel的检出率为 95 % (19/ 2 0 ) ,对 2 0份HIV Ab阳性Panel通过率为90 % (18/ 2 0 ) ,P2 4 gp4 1对 2 0份HIV Ab阳性Panel检出率为 90 % (18/ 2 0 ) ,对 2 0份HIV Ab阴性Panel的通过率为6 0 % (12 / 2 0 ) ;rP2 4和P2 4 gP4 1对正常人血清的检测结果均为阴性。结果表明研制的P2 4具有较高的敏感性和特异性 。

中试规模纯化重组鼠疫rF1-V融合蛋白及其免疫原性分析

重组F1-V融合蛋白(rF1-V)是目前在进行临床研究的鼠疫亚单位疫苗的主要成分。本研究摸索了rF1-V的可溶表达条件,并对条件进行了优化和放大,确定的中试发酵工艺为:在重组菌对数生长期中期加入50μmol/LIPTG,25℃诱导表达5h。通过硫酸铵分级沉淀、离子交换、疏水相互作用层析和凝胶过滤四步纯化,最终得到纯度为99%、回收率大于20%且各项检测指标合格的蛋白。在此基础上,将蛋白使用氢氧化铝佐剂进行吸附,在小鼠体内进行了免疫原性研究。ELISA测定两次皮下免疫后血清的抗体滴度。比较融合蛋白免疫组(rF1-V)与单一抗原免疫组(rF1、rV)以及联合抗原免疫组(rF1+rV)之间体液免疫反应的差异。结果显示:20μgrF1-V免疫剂量组诱导的抗F1抗体滴度明显高于其他组,抗V抗体滴度与其他组相比没有显著差异。表明本工艺制备的rF1-V抗原有望作为鼠疫亚单位疫苗的主要组分。

蛋白体佐剂及用于鼠疫F1-V抗原的免疫效果

目的以蛋白体（proteosomes）佐剂，非共价结合鼠疫F1-V重组蛋白为免疫原，探讨滴鼻免疫BALB／c小鼠后诱导的免疫应答和免疫保护效果。方法佐剂与鼠疫F1-V重组蛋白为免疫原非共价结合，滴鼻免疫BALB／c小鼠4次后，采用间接ELISA检测血清特异性抗F1-V的IgG和IgA抗体及抗体亚型分类，并检测鼻咽、肺、小肠及阴道灌洗液中特异性抗F1-V的黏液分泌型IgA；并用流式细胞术检测鼻相关淋巴组织淋巴细胞、脾淋巴细胞、肠系膜淋巴结及小肠PP结T淋巴细胞表型的变化。第4次免疫后7d，用100峨的鼠疫141强毒株进行腹腔攻毒。结果（1）以蛋白体为佐剂的鼠疫F1-V抗原与单纯的F1-V组相比，蛋白体疫苗组诱导血清IgG、IgA抗体显著升高（P〈0．01），同时蛋白体疫苗组能诱导鼻咽、肺、小肠和阴道内多个黏膜部位特异性IgA抗体的产生，尤其是肺和生殖道冲冼液内抗体升高极为显著（P〈0．01）；（2）蛋白体疫苗组主要引起IgG1型抗体，主要诱导TH2型免疫反应；（3）蛋白体疫苗组NALT和SP中CD^4＋/CD^8＋比值比PBS对照有显著增高（P〈0．01），MLN和PP中CD^4＋／CD^8＋比值与PBS对照差异无统计学意义（P〉0．05）。（4）小鼠100 LD50的鼠疫141强毒株腹腔攻毒后鼠疫F1-V重组蛋白组小鼠免疫保护率为0，而蛋白体佐剂疫苗组小鼠免疫保护率为67％。结论以自制的蛋白体为鼠疫F1-V抗原的佐剂滴鼻免疫小鼠，蛋白体不仅提高鼠疫F1-V抗原的系统免疫应答，而且能诱导小鼠呼吸道、消化道和生殖道局部黏膜免疫应答。蛋白体佐剂鼠疫疫苗对100 LD50的鼠疫141强毒株腹腔攻毒具有一定的免疫保护作用，这为鼠疫黏膜疫苗的研制提供候选材料，也为鼠疫黏膜疫苗深入研究奠定了基础。

鼠疫耶尔森菌重组质粒pVAX1/F1-V的构建及其免疫效果的研究

目的获得含有鼠疫F1和V抗原编码基因的重组真核表达质粒pVAX1/F1-V,并测定其诱导特异性免疫应答的能力。方法PCR扩增鼠疫菌F1和V编码基因,分别与pGEM-T连接测序,构建pVAX1/F1-V融合重组质粒,转染Cos-7细胞,用Western blot方法鉴定目的蛋白的表达,重组质粒pVAX1/F1-V加GM-CSF佐剂免疫BALB/c小鼠,观察免疫效果,400个半数致死量(LD50)强毒鼠疫菌皮下攻毒观察保护率。结果pVAX1/F1-V在Cos-7细胞中表达,免疫鼠体内产生特异性抗体,通过抗体亚型分析、细胞因子等指标的测定表明所构建DNA疫苗以诱发TH1型免疫为主,攻毒保护率达60%。结论成功构建F1-V融合蛋白真核表达载体,具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,对强毒鼠疫菌皮下攻毒有一定的保护效力,为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础。

F1-V重组亚单位疫苗对鼠疫耶尔森氏菌141强毒株皮下攻毒保护性的研究

在此实验中，设计了一种包含2种成分的重组融合蛋白作为疫苗成分来防护鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia）可能产生的生物威胁．重组F1-V蛋白与铝佐剂结合，分别以10，20，50μg剂量免疫BALB／C小鼠，周期为2个月．检测小鼠血清抗体水平和T辅助细胞的亚型．免疫后小鼠以25～600LD50剂量的鼠疫耶尔森氏菌141强毒株进行皮下攻毒实验．结果证明，F1—V重组蛋白在小鼠体内诱导产生足够保护的免疫应答．血清IgG水平是产生最终保护力的一个重要因素．20μg的免疫剂量可以诱导血清抗体效价高达51200，使小鼠对400LD50的鼠疫耶尔森氏菌产生100％的保护．F1—V重组蛋白引发的抗体亚型主要为IgG1类，说明抗体反应趋向Th2型反应．流式细胞分析表明，铝佐剂主要帮助F1—V重组融合蛋白诱导强烈的体液免疫而不是CTL细胞免疫应答．表明F1—V重组亚单位疫苗株有希望成为一种新型的鼠疫疫苗候选株．

甲型H5N1禽流行性感冒病毒血凝素抗原和霍乱毒素B亚单位融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的构建甲型HSN1禽流行性感冒流感病毒血凝素（HA）抗原和霍乱毒素B亚单位（CTB）融合蛋白真核表达载体，并研究其在COS7细胞中的表达特性，及其在动物体内不同时间点诱导机体产生特异性抗体的情况。方法采用PCR技术分别克隆CTB基因和HA基因，并用BamHI酶切2个基因片段，在T4连接酶的作用下构建CTHA融合基因（CH基因）。双酶切后，将CH基因插入真核表达质粒pCI—neo中，构建甲型H5N1禽流感病毒融合蛋白真核表达载体（pCI—CH）。将pCICH质粒转染COS7细胞，利用Western印迹、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SD孓PAGE）检测HA抗原的表达；间接EI-ISA法检测免疫接种新西兰大白兔后其血清中HA抗原的特异性抗体效价，以及与H1N1、H9N1、H3N2和乙型流感病毒的交叉反应情况。结果pCl—CH真核表达载体（即核酸疫苗）构建成功，可在cos7细胞中高效表达，并能在大白兔体内诱导产生特异性抗pcI-cH抗体。核酸疫苗pC-CH特异性抗血清不仅可以与甲型HSNl流感病毒特异性结合（P／N〉2．1），而且可以与HINl、HgNl和H3N2毒株发生特异性反应；但该抗血清与乙型流感病毒无特异性反应。结论构建的甲型H5N1禽流感病毒核酸疫苗具有良好的免疫原性。

乙型肝炎病毒核心抗原与前S1抗原融合蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性

目的原核表达、纯化乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)(1～155)与前S1抗原(PreS1)(3～55)融合蛋白,并分析其免疫原性。方法从HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA,以其为模板,PCR分别扩增HBcAg和preS1部分基因片段及融合基因CS1,将CS1基因亚克隆入原核表达载体pET-32a(+),构建重组原核表达质粒pET-CS1,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经纯化后进行SDS-PAGE、HPLC和Western blot等分析。将纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用竞争抑制法检测血清Anti-HBc水平,间接ELISA法检测Anti-PreS1水平,并检测抗体亚类;ELISPOT法评价其细胞免疫效果。结果重组原核表达质粒pET-CS1经双酶切证明构建正确;电镜分析表明粗纯的CS1可自行组装成病毒样颗粒(VLP),直径约为30 nm;SDS-PAGE和HPLC分析显示,CS1蛋白纯度分别为98.2%和93%;纯化的CS1蛋白可与兔抗人HBcAgr多抗和鼠抗人PreS1单抗特异结合,并能诱导小鼠产生Anti-HBc和Anti-PreS1抗体,抗体亚类以IgG2a为主,并能够诱生小鼠脾细胞产生HBcAg特异性的IFNγ。结论已成功原核表达并纯化了融合蛋白CS1,纯化的CS1纯度较高,能诱导机体产生较高水平的特异性体液免疫和细胞免疫反应。

人CS1-Fc融合蛋白的真核表达、蛋白纯化及生物学效应鉴定

人信号淋巴细胞激活分子F7 (SLAMF7/CS1)是一种细胞表面糖蛋白,在多发性骨髓瘤细胞中高度表达。已有研究表明CS1是多发性骨髓瘤较为灵敏且特异的生物标志物。CAR-T细胞免疫疗法是治疗多发性骨髓瘤的新方法,其中CS1 CAR-T细胞免疫疗法针对复发性难治性多发性骨髓瘤有较好的疗效。为了检测CS1 CAR-T细胞上CS1CAR的表达效率和探寻CAR-T细胞免疫疗法的辅助手段,文中制备了一种CS1-Fc融合蛋白。首先利用PCR技术从已有质粒中扩增得到CS1的胞外段序列,再通过重叠延伸PCR与人IgG1-Fc段相连。将重组片段连接至pMH3真核表达载体上,经酶切鉴定和DNA测序后,将重组质粒pMH3-CS1-Fc-his转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO-S)。经G418加压筛选和流式细胞术鉴定,证实CS1-Fc融合蛋白在CHO-S细胞中获得了表达。利用镍柱对CS1-Fc融合蛋白进行纯化,经Western blotting鉴定,融合蛋白的分子量约为70 kDa。流式细胞术和细胞计数分析结果显示,CS1-Fc融合蛋白能有效检测CS1 CAR的表达效率,证实了CS1-Fc融合蛋白对CS1 CAR-T细胞具有活化、促增殖及促分泌细胞因子的作用。本研究结果为多发性骨髓瘤细胞免疫治疗CAR-T细胞的体外检测和效能强化奠定了实验基础。

肿瘤内皮细胞标志物1在卵巢癌诊疗中作用的研究进展

卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤,具有发病率高、致死率高的特点。由于其发病隐蔽且缺乏有效检测手段,确诊时一般已处于中晚期,因此提高卵巢癌早期诊断率可有效提高患者的预后及生存率。肿瘤内皮细胞标志物1(tumor endothelial marker 1,TEM1)是一种新近发现的卵巢癌特异性肿瘤标志物,其表达于卵巢癌细胞表面,而在正常组织中不表达或仅极低表达。该特点使TEM1成为极具潜能的卵巢癌诊断和治疗的新靶点。应用TEM1的特异性抗体结合影像学、基因工程学等技术,无论在卵巢癌影像以及治疗方面都显示出了极好的抗肿瘤效果。同时大量基于靶向TEM1的临床试验正在进行中。本文综述TEM1的发现、结构、组织表达以及其在卵巢癌诊断及治疗中的研究进展,以期为卵巢癌的治疗提供新思路。

细胞渗透肽TAT与3种弓形虫抗原的融合重组表达

为了探索新型弓形虫疫苗的传递系统,本试验分别构建了细胞渗透肽反式转录激活因子(TAT)与3种弓形虫抗原和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的重组质粒,即pET28a-TAT-EGFP,pET28a-TAT-SAG1,pET28a-TAT-GRA4和pET28a-TAT-AMA1质粒。重组质粒被转化到大肠杆菌中并通过IPTG诱导,成功进行了融合表达,表达产物采用Ni-NTA树脂进行纯化,然后进行SDS-PAGE分析。结果得到31 ku的TAT-EGFP融合蛋白、34 ku的TAT-SAG1融合蛋白、38 ku的TAT-GRA4融合蛋白和62 ku的TAT-AMA1融合蛋白,经过Western blotting分析,感染弓形虫的小鼠血清可特异性地识别融合TAT的SAG1、GRA4蛋白和微弱地识别TAT-AMA1蛋白。