F12基因复合杂合变异致遗传性FⅫ缺陷症一个家系的遗传学分析

目的对1个遗传性凝血因子Ⅻ(FⅫ)缺陷症家系进行实验室表型和基因变异分析,初步探讨其分子发病机制。方法选取2021年7月17日因"慢性胃炎"就诊于宁波市第二医院的1例遗传性FⅫ缺陷症男性先证者及其家系成员(共3代7人)作为研究对象。检测先证者及其家系成员凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血因子Ⅷ活性(FⅧ:C)、凝血因子Ⅸ活性(FⅨ:C)、凝血因子Ⅺ活性(FⅪ:C)、FⅫ活性(FⅫ:C)和FⅫ抗原(FⅫ:Ag)等指标以明确诊断。采用DNA直接测序分析F12基因的所有外显子、侧翼、5′和3′非翻译区及家系成员相应的变异位点区域,用克隆测序进一步证实所发生的变异。用生物信息学软件分析变异对蛋白功能的影响。结果先证者为47岁男性,APTT为180.0 s,明显延长,FⅫ:C和FⅫ:Ag均<1.0%,极度降低。先证者父亲、母亲、弟弟、大儿子及小儿子FⅫ:C和FⅫ:Ag均有不同程度降低。基因分析显示先证者F12基因第10外显子存在c.1092_1093insC(p.Lys365Glnfs*69)杂合插入变异及第14外显子存在c.1792_1796delGTCTA(p.Val579Hisfs*32)杂合缺失变异,c.1092_1093insC为已报道的致病性变异。其母亲和大儿子携带c.1092_1093insC杂合插入变异,父亲、弟弟和小儿子携带c.1792_1796delGTCTA杂合缺失变异。第1外显子启动子区46C/T多态性分析显示先证者、大儿子和小儿子为46T/T型,其余人均为46C/T型。生物信息学软件分析第579位氨基酸残基为高度保守的位点,变异后增加了一个苯环及周围氨基酸的氢键发生了改变。根据美国医学遗传学与基因组学学会相关遗传变异分类标准和指南,c.1792_1796delGTCTA变异评级为致病性变异(PVS1+PM2_Supporting+PM4)。结论F12基因母源的c.1092_1093insC(p.Lys365Glnfs*69)杂合插入变异及父源的c.1792_1796delGTCTA(p.Val579Hisfs*32)杂合缺失变异可能是该家系FⅫ水平降低的原因。上述发现丰富了FⅫ缺乏症的基因-表型谱。

F12基因起始密码子c.1A>G变异所致遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症一家系的遗传学分析

目的探讨1个姨表近亲婚配的遗传性凝血因子Ⅻ(FⅫ)缺陷症家系的临床特征与遗传学病因。方法选取2021年7月12日于瑞安市人民医院泌尿外科就诊的1个遗传性FⅫ缺陷症家系为研究对象。收集家系临床资料,抽取受试者外周静脉血样,分别进行凝血指标检测与基因检测,采用Sanger测序进行家系验证,并对候选变异进行生物信息学分析。结果遗传性FⅫ缺陷症家系成员共3代6人,包括先证者及其父亲、母亲、妻子、妹妹和儿子。先证者为男性,51岁,临床表现为肾结石。凝血指标检测结果显示,先证者活化部分凝血活酶时间(APTT)显著延长,FⅫ活性(FⅫ:C)与FⅫ抗原(FⅫ:Ag)均极度降低;先证者父亲、母亲、妹妹和儿子FⅫ:C和FⅫ:Ag均降低至正常参考值下限的一半左右。基因检测结果提示,先证者F12基因第1外显子起始密码子存在c.1A>G(p.Arg2Tyr)纯合错义变异。经Sanger测序验证,先证者父亲、母亲、妹妹和儿子均携带F12基因c.1A>G杂合变异,先证者妻子未见该变异。该变异在HGMD数据库未见报道。经SIFT在线软件分析,预测该变异为有害性变异;经Swiss-Pbd Viewerv4.0.1软件模拟,该变异对FⅫ蛋白的结构影响较大。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)制订的《序列变异解释的标准和指南》,对该变异评级为可能致病性变异。结论F12基因c.1A>G(p.Arg2Tyr)变异可能为该姨表近亲婚配的遗传性FⅫ缺陷症家系的遗传学病因,进一步丰富了F12基因变异谱,为该病家系临床诊断与遗传咨询提供参考依据。

凝血因子Ⅻ缺乏症患者F12基因的变异分析及分子机制探讨

目的对20例凝血因子Ⅻ(FⅫ)缺乏症患者进行F12基因的测序分析并探讨其分子机制。方法选择2020年7月至2022年1月期间就诊于山西医科大学第二医院门诊部的20例FⅫ缺乏症患者作为研究对象。采用一期法检测其凝血因子Ⅷ(FⅧ:C)、Ⅸ(FⅨ:C)、Ⅺ(FⅪ:C)和Ⅻ(FⅫ:C)的活性。用Sanger测序对其F12基因的14个外显子以及5′和3′非翻译区进行分析,确定其变异位点。用生物信息学软件预测变异的致病性、分析氨基酸的保守性并模拟变异蛋白的模型。结果20例患者的FⅫ:C介于0.07%~20.10%之间,远低于正常参考值,其他凝血指标则均未见异常。Sanger测序共发现10人携带F12基因的变异,具体包括4例错义变异[c.820C>T(p.Arg274Cys)、c.1561G>A(p.Glu521Lys)、c.181T>C(p.Cys61Arg)和c.566.G>C(p.Cys189Ser)],4例缺失变异c.303_304delCA(p.His101GlnfsX36),1例插入变异c.1093_1094insC(p.Lys365GlnfsX69)以及1例无义变异c.1763C>A(p.Ser588*)。其余10人仅检测出46C/T变异。其中,c.820C>T(p.Arg274Cys)杂合错义变异以及c.1763C>A(p.Ser588*)纯合无义变异未见临床遗传变异数据库和人类基因突变数据库收录。生物信息学分析提示,p.Arg274Cys与p.Ser588*均为致病变异,相关的氨基酸位点在不同物种中高度保守。蛋白预测模型提示,p.Arg274Cys破坏了原有氢键作用力,同时侧链变短,可影响FⅫ蛋白二级结构的稳定性,使关键的结构域发生变化。p.Ser588*导致FⅫ蛋白C端截短,改变了蛋白质结构的空间构象,可能影响丝氨酸蛋白酶的切割位点,导致FⅫ:C极度降低。结论在一期法检出的FⅫ:C偏低的患者中,50%携带F12基因的变异,其中c.820C>T错义变异和c.1763C>A无义变异是导致凝血因子Ⅻ减低的新的变异。

复合杂合突变导致的遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症家系分析

目的:对1个遗传性凝血因子Ⅻ(FⅫ)缺陷症家系进行临床表型及基因突变分析,探讨其分子致病机制。方法:检测先证者及其家系成员(共3代5人)血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原含量(FIB)、D-D二聚体(D-D)、凝血因子Ⅻ促凝活性(FⅫ:C)和凝血因子Ⅻ抗原(FⅫ:Ag)等凝血指标。采用高通量测序方法分析先证者F12基因所有的外显子编码区及外显子-内含子交界处的基因突变情况,对检出的可疑致病突变进行Sanger测序验证,并对家系成员的相应突变位点进行检测。采用AutoPVS1和Mutation Taster在线生物信息学软件预测突变位点对蛋白功能的影响。结果:先证者APTT结果为180.9 s,明显延长;FⅫ:C和FⅫ:Ag分别降低至0.8%和4.17%。全外显子组测序分析发现先证者F12基因存在复合杂合突变,即第11号外显子c.1261G>T杂合无义突变(p.Glu421*)和第4号外显子c.251dupG杂合移码突变(p.Trp85Metfs*53),均为功能缺失型突变,属于极强致病性级别。Sanger测序家系验证结果显示,先证者c.1261G>T杂合突变遗传自其母亲,其哥哥和女儿均为c.1261G>T杂合突变携带者。在此家系中基因检测结果与血液学检查结果相符,即基因型和表型共分离。结论:F12基因第11号外显子c.1261G>T杂合无义突变和第4号外显子c.251dupG杂合移码突变是本例家系遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症的分子发病机制,这两个突变均为国际上首次报道的新突变。

一个复合杂合变异导致的遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症家系分析

目的检测1个遗传性凝血因子Ⅻ(coagulation factorⅫ,FⅫ)缺陷症家系的基因变异,探讨其分子致病机制。方法用DNA直接测序法对F12基因进行变异分析;在野生型pIRES2-EGFP/FⅫ表达质粒基础上,构建变异型FⅫ表达质粒,Polyfect转染试剂瞬时转染293T细胞,分别测定上清液中FⅫ活性(FⅫactivity,FⅫ∶C)和FⅫ抗原(FⅫantigen,FⅫ∶Ag),测定细胞裂解液中FⅫ∶Ag,并用Western印迹进行验证。结果先证者F12基因第1外显子启动子区为46TT基因型,在第13和14外显子存在g.8489G>A(p.Glu502Lys)和g.8699G>C(p.Gly542Ser)复合杂合变异。瞬时转染结果显示,FⅫp.Glu502Lys变异体蛋白上清液中FⅫ∶C和FⅫ∶Ag分别为野生型的28%和24%,细胞裂解液中FⅫ∶Ag为野生型的39%;FⅫp.Gly542Ser变异体蛋白上清液中的FⅫ∶C和FⅫ∶Ag分别为野生型的32%和17%,细胞裂解液中FⅫ∶Ag为野生型的59%。结论先证者F12基因型46TT,p.Glu502Lys和p.Gly542Ser复合杂合变异导致其FⅫ水平极度降低;体外表达实验证实变异蛋白p.Glu502Lys和p.Gly542Ser存在合成和分泌障碍。