羊口疮病毒F1L基因真核表达载体的构建及鉴定

为构建羊口疮病毒F1L基因的真核表达载体,以ORFV-DZ分离株基因组作为模板,PCR特异性扩增F1L基因,扩增产物与pEGFP-N1质粒连接构建重组质粒pEGFP-F1L,经测序和酶切验证的阳性重组子转染HEK-293t细胞进行表达,通过荧光显微镜观察和Western blotting对融合蛋白的表达进行鉴定。结果:PCR产物长度为1 029 bp,与F1L基因片段长度相符;阳性重组质粒pEGFP-F1L转染HEK-293t细胞可观察到明显绿色荧光,表达的融合蛋白大小约65 ku,与预期相符。结论:试验成功构建了pEGFP-F1L真核表达载体。

135位点表达ORFVF1L基因的重组山羊痘病毒的构建

【目的】采用Cre/Loxp基因编辑系统,在羊痘病毒135基因位点插入ORFV外源基因F1L,同时引入标记基因,从而构建重组山羊痘病毒,为临床上预防羊口疮疫苗的设计、研制提供参考。【方法】以pDonor载体为基础,135基因编码区两侧500 bp左右的片段作为上下重组同源臂,中间插入羊口疮病毒F1L基因编码区及标记基因gpt、EGFP、痘病毒早晚期启动子p7.5、p11,并且含有loxp位点,构建同源重组供体质粒命名为pGTPV(135)-ORFV-F1L;并对阳性克隆菌液进行PCR鉴定并测序,经测序正确的菌液接种氨苄LB液体培养基培养过夜,提取去内毒素的质粒并进行双酶切鉴定。山羊痘病毒弱毒株感染永生化山羊睾丸细胞2 h后,重组质粒经脂质体法转染永生化山羊睾丸细胞,观察细胞病变及EGFP标记基因的表达情况;48 h后收获病毒液,反复冻融后离心,盲传3代,通过PCR鉴定目标基因的整合情况,以羊口疮病毒阳性血清为一抗,驴抗山羊IgG为二抗,通过蛋白免疫印迹分析目标基因的表达情况来对获得的重组病毒进行鉴定。【结果】经PCR筛选,成功获得表达羊口疮病毒F1L基因的同源重组供体质粒。经过测序并与目标序列进行比对,结果正确,表明重组质粒成功构建。重组质粒经去内毒素提取后测定浓度并进行双酶切鉴定,结果与预期相符,经鉴定的重组质粒转染山羊睾丸细胞,在48 h后观察到细胞病变及绿色荧光,PCR鉴定结果表明F1L基因整合到重组病毒上。蛋白免疫印迹分析显示,检测到目标蛋白条带,说明重组山羊痘病毒插入的外源基因F1L基因成功表达。【结论】本研究成功构建了一种在135基因位点表达羊口疮病毒F1L基因的重组山羊痘病毒,并在永生化山羊睾丸细胞中,该重组病毒展现出目的基因的稳定表达。以羊痘病毒弱毒株135基因位点插入羊口疮病毒F1L外源基因,该重组病毒在永生化山羊睾丸细胞中获得,目的基因能稳定表达,成功构建135基因位点插入羊口疮病毒F1L基因的重组山羊痘病毒方法。

羊口疮病毒内脏和口唇感染株B2L和F1L基因的比较分析

【目的】分析内脏和口唇感染羊传染性脓疱病病毒主要致病因子F1L和B2L基因和蛋白的差异,为进一步研究该病毒的致病机制提供参考。【方法】对内脏和口唇感染株F1L和B2L基因进行PCR扩增后克隆测序,运用生物信息学软件对其序列及编码蛋白的二级结构、磷酸化位点和跨膜结构域进行预测和分析。【结果】内脏株和口唇株的F1L基因长度均为1 564 bp,分别编码342和343个氨基酸;B2L基因长度均为1 370 bp,均编码378个氨基酸。内脏和口唇感染株B2L基因核苷酸序列同源性为97.80%,氨基酸序列同源性为98.15%;两者的F1L基因核苷酸序列同源性为95.49%,氨基酸序列同源性为87.20%。氨基酸组成显示:内脏和口唇感染株B2L蛋白缬氨酸含量最高;口唇株F1L蛋白亮氨酸含量最高,内脏株F1L蛋白精氨酸含量最高。【结论】羊口疮病毒内脏和口唇感染株的B2L基因保守性良好,而F1L基因差异明显,本结果可为进一步研究羊口疮病毒致病机制提供参考。

羊口疮病毒重庆株F1L基因克隆与生物信息学分析

旨在分析OrfV-CQ株F1L基因的分子特点,预测其编码蛋白的生物学功能。对OrfV-CQ株F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,利用生物信息学相关软件进行序列分析并对其编码蛋白的二级结构、B细胞表位、T细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽进行预测。结果表明,OrfV-CQ株F1L基因长1 023bp,编码340个氨基酸,与Shanxi株F1L基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%和95.0%。OrfV-CQ株F1L基因编码蛋白的α-螺旋、β-片层、β-转角、无规则卷曲分别为11.21%、10.3%、2.73%、75.76%;可能存在5个B细胞优势抗原表位,3个CTL表位,4个Th细胞表位,无跨膜结构域和信号肽。

重庆地区羊口疮病毒的分离鉴定及F1L基因的原核表达

本试验旨在对重庆地区羊口疮病毒(ORFV)进行分离培养及鉴定,并研究其F1L基因序列在大肠杆菌中的表达情况。利用MDBK细胞对疑似ORFV感染的羔羊痂皮中的病毒进行分离培养;对F1L基因序列进行PCR扩增,引入限制性内切酶NotⅠ和EcoRⅠ,构建重组质粒pET-32a-F1L,转化至大肠杆菌BL21菌株后,对阳性菌株进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定。结果表明,所获得的毒株为ORFV,其F1L基因在大肠杆菌中的表达产物大小约为57.4ku,主要以包涵体形式存在,5h为最佳诱导表达时间,并具有良好的反应原性。

羊口疮病毒B2L、F1L基因融合真核表达质粒诱导小鼠的免疫应答及IL-2对其作用影响的研究

为评价羊口疮病毒(OrfV)B2L、F1L基因融合真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L免疫小鼠诱导的体液和细胞免疫应答及IL-2对其免疫作用的影响。本研究将构建的pVAX1-B2L-F1L真核质粒转染MDBK细胞后,采用RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)检测B2L-F1L融合基因在MDBK细胞中的表达;将pVAX1-B2L-F1L、pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2、pVAX1空载体、生理盐水对照组KM系小鼠通过后腿肌肉注射的方式免疫,采用ELISA方法检测免疫小鼠血清中OrfV特异性抗体以及Th1型(IL-2、IFN-γ)、Th2型(IL-4、IL-6)细胞因子;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应。结果显示,pVAX1-B2L-F1L重组质粒能够在MDBK细胞中表达;pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体及IL-2和IFN-γ水平均显著高于pVAX1-B2L-F1L组;该联合免疫组小鼠血清IL-4、IL-6细胞因子水平与pVAX1-B2L-F1L组相比差异不显著(p>0.05);该联合免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-B2L-F1L组(p<0.05)。由此表明,pVAX1-B2L-F1L能够诱导小鼠产生OrfV特异性体液免疫和细胞免疫应答,联合pVAX1-IL-2诱导的免疫反应以细胞免疫应答为主,且能够促进Th1型细胞因子的分泌。本研究为OrfV基因工程疫苗的研制提供了参考依据。

羊口疮病毒新疆野毒株SHZ1 B2L和F1L基因的克隆及遗传进化分析

为了研究羊口疮病毒(ORFv)新疆野毒株的遗传进化情况,参照GenBank公布的ORFv B2L和F1L基因序列,设计特异性引物,对ORFv SHZ1新疆野毒株B2L和F1L基因进行PCR扩增,克隆、测序后进行遗传进化分析。结果表明:新疆野毒株SHZ1与GenBank公布的不同地域的17个流行株相比,B2L基因核苷酸同源性为97.28%～98.86%,推导氨基酸同源性为88.65%～90.50%;F1L基因核苷酸同源性为94.56%～97.07%,推导氨基酸同源性为93.82%～95.88%。基于B2L基因的遗传进化树分析发现,SHZ1株B2L基因与我国现用疫苗株B2L基因亲缘关系较近;而基于F1L基因的遗传进化树显示,SHZ1株与意大利分离株的亲缘关系最近。本研究提示ORFv SHZ1株可能是国外流行株与疫苗株重组后产生的一个变异株。

羊口疮病毒疫苗株和野毒株F1L基因的比较分析

羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起的人兽共患传染病,ORFV F1L基因编码肝素结合蛋白。为比较分析ORFV疫苗株和野毒株编码的F1L基因的特征,本试验对疫苗株和野毒株的F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学相关软件及方法,对两者的F1L基因在核酸水平和氨基酸水平的变异情况及其二、三级蛋白结构变化情况进行了比较分析。结果显示,此次测定的ORFV疫苗株与野毒株F1L基因核苷酸序列相似性为95.9%,氨基酸序列相似性为94.5%。本研究结果为揭示ORFV异源宿主致弱的机制积累了资料。

羊传染性脓疱病毒内蒙分离株F1L基因的克隆与序列分析

本试验通过对羊传染性脓疱病毒内蒙分离株(OV/nm-05)进行总DNA提取,参考GeneBank中OrfVirus(Strain NZ2)株F1L基因序列设计一对引物,应用PCR技术特异性地扩增出该毒株的F1L基因的片段,并将其克隆到pGEM-Teasy载体后进行测序,得到该病毒F1L基因序列。应用计算机软件将测定序列与参考毒株OV/7、Strain NZ2、OV/C2、OV/mi-90、OV/Torino、OV/2的F1L基因序列进行比较。结果表明羊传染性脓疱病毒内蒙分离株与Strain NZ2同原性最高,达99.1%,与OV/Torino最低,但也为96.3%。说明羊传染性脓疱病毒内蒙分离株F1L基因与其他参考毒株之间差异不大。

羊口疮病毒湖北株F1L基因克隆与遗传进化分析

为了分析羊口疮病毒湖北株（ORFV-HB-YX株）F1L基因遗传变化规律,参照Gen Bank公布的ORFV-F1L基因序列设计特异性引物,对ORFV-HB株F1L基因进行PCR扩增、克隆、测序以及遗传进化分析。结果显示：F1L基因PCR扩增产物大小为999 bp,编码333个氨基酸,系统进化树显示HB-YX株与Gen Bank参考毒株的核苷酸序列同源性为95.0%-98.0%,与福建FJ-GO株同源性高达98%,亲缘关系最近,属于同一分支。

羊传染性脓疱病毒吉林分离株F1L基因的克隆与同源性分析

通过参考GenBank中羊传染性脓疱病毒的F1L基因序列设计引物,应用PCR技术的特异性扩增了羊传染性脓疱病毒JLSY04株的F1L基因片段,测序得到了该病毒F1L基因序列,并与几个参考毒株序列进行比对.实验结果表明,羊传染性脓疱病毒JLSY04株与OV/Torino株同源性最低,为96.0%,与Jilin株同源性最高,为99.4%.即该羊传染性脓疱病毒JLSY04株F1L基因与其他参考毒株间的差异较小,可作为基因工程疫苗的目的基因.

西藏尼玛县羊传染性脓疱病毒B2L和F1L基因的遗传进化分析

为研究西藏尼玛县羊传染性脓疱病毒遗传进化现状,采集了西藏尼玛县内某养殖户中疑似患羊传染性脓疱的患羊唇部分泌物,采用病毒分离、PCR、基因克隆、测序等技术,将分离株的B2L、F1L和ORF020基因与GenBank公布的部分流行株相应序列进行对比分析。结果显示,B2L基因在核苷酸水平显示96.4%~98%的同源性,与吉林分离株(MG712417)的同源性最高,为98%,与广东分离株(KY053526)的亲缘关系最近,同源性为97.9%;F1L基因在核苷酸水平显示95.3%~97.5%的同源性,与陕西分离株(KJ139957)的亲缘关系最近,同源性为97.5%;ORF020基因在核苷酸水平显示95.1%~99.5%的同源性,与陕西分离株(KJ139958)亲缘关系最近,同源性为99.5%。基于B2L、F1L、ORF020遗传进化分析表明,CPDV在不同地理环境和宿主中存在基因差异,但总体表现出保守性,同时表明西藏尼玛县境内CPDV流行的复杂性,研究结果可为该地区CPDV防控等相关研究提供参考。

重庆株山羊口疮病毒的分离鉴定与F1L基因片段的克隆及序列分析

为了对重庆地区山羊口疮病毒进行分离鉴定,初步分析克隆病毒F1L基因全长序列的结构与功能,试验采用MDBK细胞培养技术,分离纯化羊口疮病毒,并对其进行间接免疫荧光和扫描电镜分析,同时依据NCBI中公布的山羊口疮病毒基因序列设计引物,利用PCR技术扩增F1L全长基因序列,测序后应用生物学软件进行分析。结果表明:扩增的F1L基因全长为1 023 bp,共编码340个氨基酸,与shanxi株(登录号HQ221964)同源性最高(98.4%),在遗传进化树中也与其聚为一簇,其对应的氨基酸序列中,α螺旋和β折叠结构较少,β转角和无规则卷曲结构较多;亲水性区域较多,抗原指数高,存在多处优势抗原表位。

羊口疮病毒贵州株F1L基因克隆及生物信息学分析

为分析羊口疮病毒贵州株(ORFV-GZ株)F1L基因的分子特点,预测编码蛋白的生物学功能,本试验对ORFV-GZ株F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学相关软件及方法,对ORFV-GZ株F1L基因进行列分析并对其编码蛋白进行了二级结构、B细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽预测。结果显示,F1L基因PCR扩增产物大小为1 029bp,编码342个氨基酸;与OV-SA00株、NZ2株、OV-IA82株和D1701株相应序列核苷酸同源性分别为98.4%、97.9%、97.8%和96.8%,氨基酸的同源性分别为98.3%、97.6%、97.3%和95.3%;系统进化树显示,ORFV-GZ株F1L基因与FJ-GT株亲缘关系最近;二级结构以α-螺旋和无规则卷曲所占比例较大,预测此蛋白可能存在7个B细胞优势抗原表位,两个跨膜区域,无信号肽区域。本试验结果将为贵州省ORFV免疫诊断及核酸疫苗研究提供理论依据。

山羊口疮病毒四川分离株F1L基因分子特征分析及抗原表位预测

为明确山羊口疮病毒(ORFV)四川分离株F1L基因分子特征并预测抗原表位,本试验利用生物信息学软件分析四川分离株ORFVF1L基因,并预测其编码蛋白的二、三级结构和B细胞表位。将F1L基因克隆转化后测序,用Mega 7.0软件比对分析该基因与其他地区来源的ORFV F1L基因的变异情况,利用SOPMA服务器预测F1L蛋白的二级结构,以DNAStar软件预测其亲水性、表面可及性、柔韧性及抗原性,以ABCpred方案作为验证并输出B细胞表位,在SWISS-MODEL服务器预测三级结构后,进一步在建模区域再验证抗原表位,最终回归蛋白质序列比对。结果显示,四川分离株ORFVF1L基因大小为1 029bp,编码342个氨基酸,基因及其编码蛋白较其他地区来源毒株有一定变异;F1L蛋白预测分析存在9个可能B细胞表位,综合三级结构预测,其122—137肽段为最优表位;所预测的四川分离株ORFV F1L蛋白优势抗原表位较其他地区具有一定特异性,较多地区在124、131、137位氨基酸出现不同。本研究结果为四川地区ORFV基因工程疫苗及特异性检测方法的研究提供了理论依据。

羊口疮病毒B2L和F1L截短融合基因原核表达产物的免疫原性分析

为分析羊口疮病毒(OrfV)B2L和F1L截短融合基因表达蛋白的反应原性,本研究分别选取B2L、F1L基因序列的主要抗原区域,采用重叠延伸PCR将二者融合后克隆至原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-32a-B2L-F1L,通过PCR、双酶切和测序鉴定,结果显示获得1080 bp的B2L-F1L融合基因目的片段,测序结果经比对分析正确无误,表明正确构建了重组表达质粒pET-32a-B2L-F1L。将pET-32a-B2L-F1L转化BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果显示表达了39 ku的重组蛋白rB2L-F1L。采用Ni-IDA亲和层析方法纯化重组蛋白,经western blot鉴定,结果显示获得39 ku的单一特异性条带,表明rB2L-F1L的纯化效果和免疫原性均较好。采用rB2L-F1L纯化蛋白皮下多点注射免疫羔羊,采用ELISA方法检测免疫后不同时间羔羊血清中的OrfV抗体、IL-2、IFN-γ和IL-4细胞因子。结果显示,与生理盐水组相比,rB2L-F1L能够诱导羔羊产生OrfV特异性抗体,并可显著或极显著诱导羔羊分泌IL-2、IFN-γ和IL-4细胞因子(P<0.05、P<0.01);与弱毒活疫苗组比较,除在免疫后14 d~28 d时rB2L-F1L诱导羔羊产生的IL-2水平显著低于弱毒活疫苗组外(P<0.05),其他细胞因子在各时段两组均无显著差异(P>0.05)。本研究首次将OrfV优势抗原基因融合表达并分析了融合蛋白的免疫原性,为OrfV的检测技术和基因工程亚单位疫苗的研发奠定了良好基础。

羊口疮病毒F1L和B2L基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达

目的为构建羊口疮病毒F1L和B2L基因真核表达质粒,同时验证其在MDBK细胞中的表达。方法本试验以pVAX1为真核表达载体,在前期构建的克隆质粒pMD18-T-B2L和pMD18-T-F1L基础上,构建真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L,对其分别进行双酶切和测序鉴定,将鉴定正确的真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L转染至MDBK细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)检测目的基因表达。结果双酶切鉴定和序列测定表明真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L构建成功,RT-PCR和IFA同时验证目的基因在MDBK细胞浆中能瞬时表达。结论本试验构建成功的真核表达质粒为下一步羊口疮病毒核酸疫苗研究奠定基础。

羊IL-2和OrfV-F1L基因疫苗联合免疫小鼠的免疫应答研究

为评价pVAX1-IL-2和pVAX1-F1L联合免疫小鼠诱导的体液和细胞免疫应答,分别将pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2、pVAX1-F1L、pVAX1空载体、PBS对照组通过后腿肌肉注射的方式免疫KM系小鼠,采用ELISA方法检测免疫小鼠血清中OrfV特异性抗体以及Th1型(IL-2、IFN-γ和TNF-α)、Th2型(IL-4、IL-6和IL-10)细胞因子;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应。结果显示,pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体效价及IL-2、IFN-γ和TNF-α细胞因子水平均显著高于pVAX1-F1L组,与pVAX1组、PBS组相比差异极显著(P<0.01);pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清IL-4、IL-6和IL-10细胞因子水平均显著高于pVAX1组和PBS组,与pVAX1-F1L组相比差异不显著(P>0.05);且pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2免疫组的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-F1L组、pVAX1组和PBS组(P<0.01)。结果表明,pVAX1-IL-2和pVAX1-F1L联合免疫小鼠,能诱导小鼠产生OrfV特异性体液免疫和细胞免疫,pVAX1-IL-2诱导的免疫反应以细胞免疫应答为主,且能促进Th1型细胞因子的分泌。

羊口疮病毒的分离鉴定及F1L基因的遗传变异分析

采用羊胚胎鼻甲(OFTu)细胞对湖北某山羊养殖场疑似羊口疮(Orf)的病羊唇部痂皮组织进行病毒分离,通过病理组织学、电镜形态观察及PCR试验等方法对分离的病毒进行鉴定,证实分离毒株为羊口疮病毒(Orf virus,ORFV),命名为HuB13。分析HuB13 F1L基因序列,结果F1L基因全长为1 017 bp,编码339个氨基酸,G+C含量为64.70%。遗传进化树显示,HuB13与8株山羊和6株绵羊来源的ORFV同源性分别为97.50%～99.41%和97.15%～97.35%,与牛痘病毒(PCPV)和牛丘疹性皮炎病毒(BPSV)同源性分别为88.0%～88.69%和75.15%。Bioedit软件分析发现宿主为山羊和绵羊的ORFV存在1个高变异区(148～171 bp)和6个特异性位点G186C、T187G、A541G、A765G、G856A和G982A。研究结果为开发宿主特异的Orf疫苗及致病机理研究提供参考依据。

表达羊传染性脓疱病毒F1L基因的重组山羊痘病毒的构建与特性鉴定

【目的】本文旨在构建可表达羊传染性脓疱病毒F1L基因的重组山羊痘病毒,并对其生物学特性进行初步研究。【方法】将羊传染性脓疱病毒F1L基因与转移载体pUC-TK12连接,同时插入LacZ报告基因和一双向启动子;将重组转移载体转染已接种山羊痘病毒的BHK-21细胞,通过蓝白斑筛选、纯化,对重组病毒进行连续传代培养,应用PCR、间接免疫荧光和Western免疫印迹等方法进行鉴定,并对重组病毒进行不同温度、酸碱度、有机溶剂和紫外照射等处理,进行TCID50评价。rGpv-F1L免疫小鼠后,经酶联免疫吸附实验检测其特异性抗体水平。【结果】成功构建重组病毒转移载体pTL-F1L,将转移载体转染BHK-21细胞后,通过蚀斑纯化获得了可稳定遗传的rGpv-F1L。间接免疫荧光和Western免疫印迹检测发现其可稳定表达F1L蛋白。55℃30min或紫外照射1h即可灭活重组病毒,且其对强酸、强碱、有机溶剂等较敏感。接种重组山羊痘病毒的小鼠40d内机体可持续产生高水平的特异性抗体,与接种Gpv病毒组相比差异极显著(P<0.01)。【结论】本文获得了可稳定表达羊传染性脓疱病毒F1L的重组山羊痘病毒疫苗候选株,其具有良好的抗原性和生物学活性,为同时预防羊传染性脓疱病和羊痘提供新途径。