AD5/F35腺病毒载体对不同来源造血系统恶性细胞转染效率的研究

本研究比较AD5/F35腺病毒载体对不同来源的血液系统恶性细胞系感染效率的差异和细胞毒性反应。用AD5/F35-EGFP以不同MOI(感染复数)感染不同来源的血液恶性细胞系并用AD5-EGFP作为对照;用流式细胞术检测荧光阳性细胞比例,进行荧光显微镜照相并用MTT法检测病毒对感染靶细胞的杀伤作用。结果表明:对于髓系来源的细胞在MOI为30时,AD5/F35载体的感染效率大于99%,AD5载体在MOI为1000时感染效率为26.4%;对于B系来源的细胞在MOI为1000时,AD5/F35载体感染效率为11.7%,AD5载体为5.7%;AD5/F35和AD5载体都不能有效地感染T系来源细胞,在MOI达到1000也未检测到荧光阳性细胞。在MOI为1000的情况下AD5/F35载体对感染靶细胞也无明显杀伤作用。结论:AD5/F35载体对不同来源的血液恶性细胞的感染具有一定的选择性,对髓系来源细胞感染能力强,对B系来源细胞有一定感染能力,而且对感染靶细胞毒性小。AD5/F35载体优于常用的5型腺病毒载体,在以髓系细胞为靶细胞的基因治疗中有着较好的应用前景。

嵌合性5型腺病毒载体Ad5/F35体外转染大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的:研究携带35型腺病毒纤毛的嵌合性5型腺病毒载体Ad5/F35能否有效地将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),并观察eGFP基因在大鼠BMSCs内持续表达的时间。方法:贴壁培养法分离、扩增大鼠BMSCs。用带有eGFP基因的Ad5/F35(Ad5/F35-eGFP)分别以1、10、100、1000的感染复数(MOI)转染第2代大鼠BMSCs;荧光倒置显微镜和流式细胞仪(FCM)检测eGFP基因的转染效率与表达水平,观察细胞生长状态以评估病毒对大鼠BMSCs基本生物学特性的影响;对MOI=100的病毒转染的大鼠BMSCs在转染后第2、7、14、21、30天分别用FCM检测大鼠BMSCs内eGFP的表达情况。结果:MOI在1到1000范围内,eGFP基因转染效率和表达水平与Ad5/F35-eGFP的MOI呈正向剂量相关性。MOI=100的病毒可转染90%左右的大鼠BMSCs,且eGFP基因在1个月内均有表达。MOI为1、10、100的病毒不影响大鼠BMSCs的活力和增殖能力。结论:Ad5/F35可以高效地将eGFP基因体外转染大鼠BMSCs,eGFP基因可持续表达1个月。本研究为Ad5/F35作为BMSCs的基因转移和表达载体进行细胞治疗与基因治疗提供了实验依据。

人Wilms瘤基因1重组腺病毒Ad5/F35的制备及感染树突状细胞后的鉴定

目的构建人Wilms瘤基因1(WT1)重组腺病毒载体Ad5/F35并鉴定。方法运用不同病毒滴度的Ad5-EGFP和Ad5/F35-EGFP感染黑素瘤患者外周血树突状细胞(DC),用荧光显微镜检测EGFP的表达,选择对DC感染率高的腺病毒;同源重组构建Ad5/F35-WT1腺病毒载体,用免疫细胞化学和流式细胞术(FCM)检测WT1的表达。结果在相同滴度下,腺病毒载体Ad5/F35的感染优于Ad5;成功构建了Ad5/F35-WT1重组腺病毒,免疫细胞化学染色和FCM证实该病毒能有效介导WT1在DC中的表达。结论 Ad5/F35-WT1重组腺病毒能将WT1基因成功导入DC并有效表达。

重组腺病毒Ad5F35-IL-12感染不同单核-巨噬细胞的研究

目的确定人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12在不同人单核-巨噬细胞中的表达。方法将人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12分别感染人外周血单个核细胞、胸水巨噬细胞,以及THP-1和U937单核细胞株及其经佛波酯(PMA)诱导后生成的巨噬细胞;感染48 h后荧光显微镜观察对相应细胞的感染效率,RT-PCR检测IL-12双亚基p35和p40的mRNA表达情况,ELISA检测细胞培养上清中IL-12p70的分泌水平。结果人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12可成功感染人外周血单个核细胞、胸水巨噬细胞以及THP-1和U937单核细胞株及其PMA诱导后生成的巨噬细胞,并分泌IL-12 p70蛋白,蛋白表达量从高至低依次是胸水巨噬细胞、PMA诱导后U937细胞、PMA诱导后THP-1细胞、U937细胞、外周血单个核细胞、THP-1细胞。结论人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12可以感染不同的单核-巨噬细胞,并成功表达分泌IL-12 p70蛋白。

共表达CD40L和IL-2的腺病毒对树突状细胞成熟和IL-12产生的影响

目的探讨共表达人CD40L和IL-2的5/F35嵌合型腺病毒载体(Ad5/F35 CD40L-IL-2),对人单核细胞来源的树突状细胞(Mo-DC)的感染效率及感染后对Mo-DC表型及IL-12产生的影响。方法提取人外周血单个核细胞(PBMCs)总RNA,应用RT-PCR方法克隆CD40L和IL-2,构建Ad5/F35 CD40L-IL-2腺病毒载体。分离和培养人Mo-DC后,应用流式细胞仪分析嵌合型腺病毒载体对Mo-DC的感染效率、CD40L基因表达及感染前后Mo-DC表型的变化;采用ELISA法测定Mo-DC培养上清中细胞因子IL-2和IL-12的含量。结果成功克隆CD40L和IL-2基因并构建成5/F35嵌合型腺病毒载体。Ad5/F35嵌合型腺病毒载体能高效感染Mo-DC,感染效率可达75%以上,Ad5/F35 CD40L-IL-2感染Mo-DC能有效地表达CD40L和分泌IL-2。感染前Mo-DC中CD80、CD86、CD40和HLA-DR呈一定水平表达,而CD83表达水平较低,感染24 h后,CD80、CD86、CD40和HLA-DR表达水平明显上调,特别是CD83。感染不同时间点测定Mo-DC上清IL-12水平,上清中IL-12水平升高呈时间依赖性。结论 Ad5/F35 CD40L-IL-2能高效感染人Mo-DC并表达相应的基因产物,促进Mo-DC成熟和刺激IL-12的分泌。

APE1在PDT治疗非小细胞肺癌中的表达变化及疗效的关系

目的探讨光动力疗法(PDT)治疗非小细胞肺癌对脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)表达的影响及疗效的关系。方法以Western blot分析PDT处理调控作用影响A549细胞APE1表达变化的时效关系,构建Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒干扰载体,通过Western blot检测其对APE1蛋白的敲低作用,设空白对照组、Ad5/F35-APE1 siRNA感染组、PDT组和Ad5/F35-APE1 siRNA+PDT组,采用MTT法观察不同组对A549细胞的增殖抑制作用。结果PDT诱导A549细胞APE1蛋白表达增强在24h达到高峰,10MOI Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒感染A549细胞48h抑制APE1表达最为显著,MTT检测显示随光照剂量的增加增殖抑制作用显著增强,同时Ad5/F35-APE1 siRNA+PDT组对A549细胞具有明显的增殖抑制作用。结论Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒能有效抑制PDT诱导的肺癌细胞APE1表达增加,明显增强PDT对肺癌细胞的杀伤效应。