产肠毒素大肠杆菌F41菌毛抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的重组F41菌毛蛋白作为检测抗原,建立了检测产肠毒素大肠杆菌F41菌毛抗体的间接ELISA方法。经优化筛选的最佳反应条件:包被抗原浓度为0.26μg/孔,血清稀释度为1∶800,酶标二抗工作浓度为1∶6 000,30 g/L明胶封闭1 h,底物作用时间为10 min。经试验验证,该方法具有特异性好、敏感性高、重复性好、稳定性强等特点。用建立的间接ELISA方法与PCR方法进行符合性试验,总符合率为97.4%。表明,该方法可以用于产肠毒素大肠杆菌F41菌毛抗体的检测。

产肠毒素性大肠杆菌致病因子F_(41)、K_(99)菌毛基因的克隆与表达

目的为了分析原核表达的ETECF41和K99菌毛亚单位的抗原性和作为基因工程亚单位疫苗的可能性。方法针对黏附素F41和K99的编码序列,设计两对特异性引物,扩增F41和K99菌毛蛋白的编码基因,经序列测定后,克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化E.coliBL21(DE3),筛选到可以表达F41和K99菌毛亚单位的菌株。经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot试验分析原核表达的F41和K99重组蛋白的抗原性。结果表达的F41和K99菌毛亚单位蛋白可以与抗F41和K99菌毛蛋白的单因子血清反应。结论原核表达的F41和K99重组蛋白具有良好的抗原性。

牛源大肠杆菌F41菌毛蛋白的原核表达和多克隆抗体的制备

目的原核表达及纯化牛源产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)F41菌毛蛋白,并制备F41菌毛蛋白的多克隆抗体。方法以ETEC基因组为模板,采用PCR法扩增F41菌毛基因,克隆入表达载体pQE-30,转化大肠杆菌XL1-Blue,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE分析,表达产物经切胶纯化,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测定抗血清效价,Western blot分析F41菌毛蛋白与多抗的反应原性。结果重组表达质粒pQE-30-F41经双酶切及测序证实构建正确;F41菌毛重组蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为32 000;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,纯化的重组蛋白纯度可达92%;制备的抗血清效价达1∶2.56×106以上,Western blot结果表明F41菌毛蛋白与制备的多抗具有良好的反应原性。结论已成功原核表达并纯化了F41菌毛重组蛋白,且制备了高效价的多克隆抗体,为单克隆抗体制备及其免疫检测方法的建立奠定了基础。

仔猪黄痢K88-K99-987p-F41多价菌毛疫苗的制备及小鼠免疫试验

为了更好地预防仔猪黄痢,选取野生分离菌株HN2001(K88ab)、HN2002(K88ac)、HN2003(K 88ad)、HN2004(K 99)、HN2005(987p)和HN2006(F41)培养后用低温磁力搅拌法提取菌毛,制成5批多价菌毛混合油乳剂灭活苗。试验结果表明,5批多价灭活疫苗对小鼠的平均保护率达95.0%,为进一步进行本体动物试验提供了有价值的参考资料。

产毒性大肠杆菌菌毛F_(41)抗原单克隆抗体及其免疫学特性的鉴定

产毒性大肠杆菌(ETEC)是婴儿和幼畜急性腹泻的重要病原之一，其致病因子主要有腑毒素和定居因子(又称粘附素)。现已证明，菌毛抗原是介导ETEC粘附肠上皮细胞的定居因子；是该茁感染的第一步．也是人们注目的预防该菌感染的菌毛疫苗组分。F41菌毛抗原是近年来才发现的畜源性ETEC的一种新的定居因子。因此．F41菌毛抗原单克隆抗体及其免疫学特性的研究，对探讨ETEC的致病与免疫机制，检验诊断及特异预防将提供有用的制剂。

牛产肠毒素大肠杆菌毒力因子多重PCR检测方法的建立

通过多重PCR扩增产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigentic E.coli,ETEC)的毒力因子F41菌毛、K99菌毛和STa肠毒素的编码基因来检测和鉴定ETEC。试验中对影响PCR扩增的dNTP、Mg2+、引物浓度以及退火温度等因素进行优化,在优化条件的基础上,确定多重PCR的特异性和灵敏性,以此建立同时检测ETEC多个毒力因子的多重PCR方法。用该方法对分离于犊牛腹泻和犊牛肠毒血症的7株大肠杆菌进行检测,结果2株为F41、K99和STa阳性,4株为F41、STa阳性,1株为K99、STa阳性。这与玻片凝集试验检测菌毛的结果一致。试验表明,该方法特异性强、敏感性高、简便、快速,适用于临床鉴定和检测牛ETEC菌株。

致犊牛腹泻肠毒素大肠杆菌多重PCR检测方法的建立

肠毒素大肠杆菌((Ent erot oxi geni c E.col i,ETEC)是引起犊牛腹泻的主要病原之一。本试验建立了多重PCR检测ETEC毒力因子F41菌毛、K99菌毛和STa、LT肠毒素相关基因的技术方法。试验对影响PCR扩增的dNTP、引物浓度以及退火温度等因素进行优化,确定了多重PCR的特异性和灵敏性。结果表明:所建立的多重PCR方法快速、特异、灵敏,在2.5h-3h内就可以完成,为致犊牛腹泻肠毒素大肠杆菌的快速准确检测提供另一种选择。

重组质粒pMG611中K99和F41抗原基因在E.coli中表达条件的研究

本文通过 ELISA 方法测定了重组质粒 pMG611在不同宿主和培养条件下,K99和 F41菌毛抗原的表达水平。研究结果表明重组质粒 pMG611在 HB101和 RRI 宿主菌中较在 C600宿主菌中表达更多的 K99和 F41菌毛抗原。实验中还探讨了培养基、温度和丙氨酸对两种菌毛抗原表达的影响。