产肠毒素大肠杆菌F5菌毛基因的克隆与表达

应用PCR方法从产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)中扩增出不含信号肽序列的F5菌毛抗原基因片段,克隆测序后将其连接到大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,转化工程菌BL21,经IPTG诱导表达。经SDS-PAGE和Western Blot分析,重组蛋白在BL21中得到表达并与F5菌毛单因子血清发生明显反应。

大肠杆菌F_5菌毛胶体金免疫层析检测方法的建立

为建立一种特异、稳定、敏感的检测产肠毒素大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析方法,用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗F5菌毛单克隆抗体,并喷涂在结合垫上;将纯化的兔抗F5菌毛多克隆抗体和羊抗鼠IgG包被于硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线;组装试纸条,进行敏感性、特异性、稳定性、重复性试验,并对模拟样品和临床样品进行初步检测。结果显示,对F5菌毛蛋白的最小检出量为38.2μg/mL;与大肠杆菌F4、F6、F41和F18ab菌毛无交叉反应;4℃条件下密封保存120d后仍能有效检出样品;批内、批间检测F5菌毛蛋白的结果没有差别且检测线清晰,具有良好的重复性;对14份临床样品检测的结果与间接夹心ELISA、平板凝集试验、PCR的符合率为100%。

ETEC F4-F5融合基因表达及间接ELISA方法建立

表达产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)黏附素F4和F5融合蛋白,建立间接ELISA方法,旨在监测猪场ETEC感染以及疫苗免疫情况。根据GenBank中登录F4和F5基因序列,分析保守区,优化密码子,合成F4-F5串联基因,克隆入原核表达载体,表达重组蛋白His-F4-F5。以纯化的His-F4-F5蛋白作为检测抗原,建立检测ETEC抗体的间接EIISA方法。经酶切和DNA序列分析,成功构建重组菌BL21(pCold I-F4-F5),SDS-PAGE和Western blot分析,融合表达F4-F5相对分子质量为29 000,与ETEC高免血清发生特异性反应,条带单一。经优化筛选的间接ELISA最佳反应条件:抗原包被浓度6ng/孔,待检血清稀释比例1∶200,HRP-羊抗猪二抗的工作浓度1∶15 000,5%脱脂奶封闭l h,底物作用时间15min。本研究建立F4-F5间接ELISA方法具有特异性好、敏感性高、重复性好、稳定性强的特点,是猪场ETEC感染和疫苗免疫效果检测的有效工具,进而指导疫苗使用和新型疫苗研发。