嵌合猫杯状病毒F9株感染性克隆的构建及病毒拯救

为构建猫杯状病毒(FCV)弱毒株F9的感染性克隆,本研究利经PCR分段扩增了FCV各基因片段,并拼接出FCVF9全基因组序列。经测序显示,其1823位多出一个碱基造成该序列存在移码突变,经替换为pOK-2280(已构建出的FCV强毒株的感染性克隆)相应序列并对差异氨基酸逐个突变,最终获得嵌合FCVF9全基因组的重组质粒pOK-F9H。将线性化的pOK-F9H体外转录,获得的加帽RNA转染F81细胞,得到了拯救病毒rFCVF9。经过对拯救病毒与亲本病毒的蚀斑形成能力、CPE形成能力和多步生长曲线分析,结果显示rFCVF9与亲本株在复制能力和体外生长能力方面基本一致,表明构建了嵌合FCVF9株的感染性克隆并拯救出重组病毒。本研究构建的嵌合FCVF9株感染性克隆可以为FCV的基因功能研究以及新型FCV疫苗的研发奠定基础。

鸡新城疫病毒F48E9株血凝素神经氨酸酶基因免疫诱导免疫保护的初步研究

将我国新城疫病毒标准强毒F4 8E9株的血凝素 神经氨酸酶基因克隆于真核表达载体 pcDNA3 中 ,进行鉴定后筛选阳性质粒。将此阳性质粒进行大量法提取并纯化后作为基因疫苗以每只鸡 10 0 μg的剂量肌肉接种 4 5日龄SPF鸡 ,并以 pcDNA3 空质粒作为对照。结果表明 ,新城疫基因疫苗能够诱导机体产生新城疫病毒特异的血清IgG抗体反应 ,但产生抗体所需的时间较长 ,抗体滴度的增加较为缓慢。人工接种新城疫强毒后 ,基因疫苗免疫组 4 / 6的鸡得到保护 ,而且保护鸡具有明显的抗体反应 ,2只鸡未得到保护 ,但其死亡时间明显迟于对照组鸡 ,死亡鸡具有典型的新城疫病毒感染鸡的病理形态学变化。

新城疫野毒株与F_(48)E_9强毒株对不同抗体水平雏鸡的感染试验

应用新城疫野毒株与F48E9标准强毒株对母源抗体效价分别为 8.5 0、6.0 0和 4.0 0log2的雏鸡进行了攻毒试验。结果 ,新城疫野毒株的感染致死率依次为 2 0 %、10 0 %和 10 0 % ;F48E9标准强毒株的感染致死率依次为 0、10 %和10 0 %。提示 ,在目前新城疫流行日益复杂的情况下 。

鸡新城疫病毒F48E9强毒株NP基因的序列分析

根据GenBank登录的鸡新城疫病毒NP基因序列设计引物,利用RT-PCR对F48E9强毒株NP基因进行扩增,将扩增产物经纯化后连入pMD18-T载体,通过PCR和酶切鉴定出阳性重组质粒,经测序后获得F48E9 NP基因序列。经分析发现该基因的ORF总长为1 470 bp,编码489 aa,NP蛋白有4个高度保守的Cys位点,分别位于第55、78、139、213位,且在401～440位和461～481位区域变异较大。将F48E9株与19株参考毒株的相应序列进行比较得到核苷酸序列同源性为87.9%～92.3%,氨基酸序列同源性较高,为92.2%～98.0%,遗传进化分析表明F48E9株相对独立,与参考毒株的遗传距离较远。

新城疫病毒F_(48)E_9株NP基因的克隆与序列分析

根据NDVNP蛋白已知基因序列设计合成了一对引物 ,利用RT_PCR扩增出了F4 8E9株NP基因 15 98bp的片段 ,将该片段克隆到pMD18_TVector上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子。为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性 ,采用Sanger′s双脱氧末端终止法对阳性重组子进行核苷酸序列测定 ,获得了F4 8E9株NP基因片段的基因序列 ,利用DNASIS分析软件 ,将F4 8E9株与LaSota株的相应序列进行比较 ,其核苷酸序列同源性为 88.2 %。至此 ,我们获得了F4

16S rDNA序列分析鉴定一株合浦珠母贝共附生乳酸菌

从合浦珠母贝(Pinctada fucata)粘液中分离纯化得到一株抗菌物质产生菌F9,利用16S rDNA方法鉴定该菌株为棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)。通过琼脂扩散法测定了该菌的抑菌谱,发现该菌发酵液上清液在排除有机酸和过氧化氢(H2O2)的影响后仍对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)等多种食源性致病菌有明显的抑菌作用。对该菌发酵液抑菌物质进行超滤分析及蛋白酶处理,可推断该抗菌物质为分子量在5～10 kDa的蛋白类物质。

新城疫病毒强毒株F48E9致病性细化分型的鉴定

为了确证我国标准速发型新城疫强毒株F48E9致病性的细化分型,分别采用泄殖腔涂抹、泄殖腔注射、点眼滴鼻和静脉注射4种感染途径,用高、低2种剂量对SPF鸡进行感染,综合分析临床症状和病理变化。结果显示：各组均出现典型神经症状,并且伴随呼吸道症状和下痢,其中高剂量组尤其是静脉注射途径,病程较短,出现明显神经症状后1-2 h死亡,病理变化不明显;低剂量组发病平缓,神经症状呈明显的渐进性,其中以点眼滴鼻途径最为明显;各感染途径剖检观察到明显的脑部及肠道出血;综合分析判定F48E9株为嗜神经型速发型强毒。同时,针对强毒株致病性的细化分型,建议采取点眼滴鼻途径和低剂量方式,综合分析临床症状和病理变化进行鉴定。对速发型新城疫病毒的细化分型鉴定能够进一步为新城疫的鉴别诊断,病毒的组织嗜性、致病机理研究提供重要的基础依据。

新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞中免疫相关细胞因子表达的检测

分别采用新城疫强毒株F48E9与新城疫弱毒株LaSota感染10日龄鸡胚制作的鸡胚成纤维细胞,感染后24h提取鸡胚成纤维细胞的总RNA,通过RT-PCR技术结合凝胶成像系统扫描检测21种免疫相关细胞因子在鸡胚成纤维细胞中的表达量。实验结果表明,在鸡胚成纤维细胞中,无论是否感染新城疫病毒,IL-2、IL-3、IL-4、IL-21不能检测到其相应条带。通过统计学分析,IFN-β、IFN-γ、IL-9、IL-12-P35、IL-12-P40在病毒感染组与对照组间呈现出显著的差异,而强毒感染组与弱毒感染组的比较中,仅IFNγ、IL-9表现出显著差异。

以rLaSota为骨架构建表达强毒株HN蛋白的嵌合体新城疫病毒

新城疫病毒(NDV)的HN蛋白是一个多功能蛋白,具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种活性,在病毒感染过程中扮演重要角色。本研究利用反向遗传操作技术,将NDV强毒株F48E9的HN基因替换弱毒株rLaSota的HN基因,获得嵌合病毒rL-F48E9HN。收获病毒尿囊液,提取基因组RNA,进行序列分析,结果显示嵌合病毒基因组的HN基因获得了正确替换。嵌合病毒在鸡胚内的生长特性与亲本株LaSota一致,与F48E9的生长特性相差甚远。嵌合病毒红细胞吸附性明显增强,较rLaSota株增加51%,而细胞融合作用无明显变化。rL-F48E9HN的鸡胚平均致死时间(MDT)为148 h,脑内致病指数(ICPI)为0.43,静脉接种致病指数(IVPI)为0,说明rL-F48E9HN的毒力仍然属于弱毒力范围,而没有达到中等毒力或者强毒力。