稀有海洋放线菌Salinispora arenicola非核糖体肽合成酶和卤代酶生物合成基因簇核心区的克隆及序列分析

克隆稀有海洋放线菌Salinispora arenicola的非核糖体肽合成酶(NRPS)和卤代酶生物合成基因簇核心区基因片段。根据已发表的放线菌NRPS和卤代酶生物合成基因簇核心区的核苷酸序列保守区设计两对简并性引物,采用PCR的方法扩增NRPS和卤代酶生物合成基因簇核心区基因片段,使用分子生物学软件进行序列分析。获得两段大小分别为662bp和557bp的基因片段,编码220个和185个氨基酸。这两段序列与海洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205的NRPS和卤代酶生物合成基因簇核心区基因核苷酸序列的同源性分别为99%和98%。成功地获得了稀有海洋放线菌Salinispora arenicola的NRPS和卤代酶生物合成基因簇核心区基因片段,该基因片段的获取将为分离全长基因簇以及研究该基因簇在生物合成中的功能奠定基础。

南海稀有放线菌的分离及其卤化酶基因分析

目的探究中国南海沉积物中放线菌的多样性并从中发现合成药物先导化合物的新菌源。方法采用6种选择性培养基分离24份来自南海沉积物样品中含有的放线菌。挑选不同培养特征的放线菌进行初步分类鉴别、16S rRNA基因序列系统进化分析及基于PCR的卤化酶基因筛选。结果共分离到900株放线菌,挑选的210株放线菌分别属于放线菌9个科,13个属,210株菌中有38株含有卤化酶的生物合成基因片段。结论海洋环境蕴含丰富的放线菌资源并具有产生天然的有活性卤化物的潜能。

参与抗生素生物合成的FADH_2依赖型卤化酶研究进展

从发现第一个天然卤化物到现在已有100多年了。在已发现的约4500个天然卤化物中有很多在医药等领域应用广泛,其中包括许多重要的抗生素。直到19世纪90年代中期,人们一直认为生物卤化反应主要由卤过氧化物酶负责催化。近期在许多关于抗生素生物合成基因簇的研究中发现FADH2依赖型卤化酶催化的卤化反应才是许多微生物及其它生物中的主要卤化机制。本文综述了参与抗生素生物合成的FADH2依赖型卤化酶的发现,催化机制及各种来源的该类卤化酶研究进展,并介绍了该类酶在组合生物合成及寻找天然卤化物等方面的应用。

海洋链霉菌Streptomyces sp.B-17卤化酶基因的克隆及生物信息学分析

海洋放线菌是生理活性物质重要的产生菌,而海洋放线菌产生的卤化酶可催化生理活性物质的卤化,极大提高了其抑菌和抗癌活性。从大连海域分离出1株链霉菌Streptomyces sp.B-17,从其基因组DNA中扩增一524 bp的基因片段,经与pMD-19T载体连接,转化大肠埃希菌JM109感受态细胞,重组质粒经鉴定证明正向插入到pMD-19T载体。生物信息学分析表明该序列与Actinocorallia herbida DSM 44252的2个依赖FADH2卤化酶基因的同源性为88%,拟编码氨基酸与色氨酸卤化酶(CP001848)的相似性也达到74%,证明所克隆的基因片段为卤化酶基因片段,为后续的基因功能分析及表达奠定了基础。

游动放线菌中orf20基因敲除对雷莫拉宁合成的影响

雷莫拉宁生物合成基因簇中orf20与已知的卤化酶基因高度同源。本研究在大肠杆菌中构建同框敲除质粒pSM-3,将其转入游动放线菌Actinoplanes sp.ATCC 33076,通过同源重组双交换的方法将orf20基因内部编码64个氨基酸的序列敲除,筛选得到双交换阻断突变株SIPI-A.2001 dorf20(Δorf20)。经发酵验证,该突变株发酵产物中没有检测到雷莫拉宁产生。推测该酶可能是雷莫拉宁生物合成途径中的一个关键酶,除卤化功能外,可能还有其它相关的功能。

抗白色念珠菌的海洋来源链霉菌L131的鉴定及活性物质的初步纯化

使用卤化酶简并引物对海洋来源的链霉菌进行了基因筛选,共得到了3株阳性菌株,并发现L131和S077菌株具有抗白色念珠菌活性.其中阳性菌株L131的16S rRNA序列与灰白链霉菌(Streptomyces canescens)DSM 40001T具有99%的相似性,但L131菌株在Bennett培养基上菌落凸起,表面褶皱,产白色孢子和淡黄色可溶性色素,不能以阿拉伯糖、果糖作为惟一碳源,与模式菌株存在着明显差异.L131菌株的抗白色念珠菌活性物质在40℃以下,pH值介于5～10范围内活性稳定,且极性大于乙酸乙酯.以AB-8为吸附树脂,首先使用40%(V/V)甲醇洗去未吸附的杂质,然后使用100%(V/V)甲醇进行洗脱,可得到初步纯化的活性物质,其对白色念珠菌的最小抑菌浓度为32.00μg/cm3.上述研究结果可为抗白色念珠菌药物的开发提供参考.

酶催化卤化和去卤化反应

通过研究微生物降解卤素化合物发现了不同种类的去卤化酶,这些酶可以在好氧或厌氧条件下通过不同的作用机理脱去卤原子催化降解卤素化合物。到目前,通过生物法得到将近4000多种卤素化合物,早期仅分离并获得了催化卤化反应的卤过氧化物酶,近来,在研究细菌卤化代谢物的生物合成时发现了以FADH2为辅基的卤化酶。这种新型的卤化酶在卤化代谢物的生物合成中起催化作用。

星海链霉菌卤化酶重组蛋白在大肠杆菌中可溶表达

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是表达异源蛋白的良好宿主,但常遇到蛋白表达产物不可溶的困难.在对来自星海链霉菌的卤化酶基因sinH进行大肠杆菌异源表达时,为克服蛋白表达产物可溶性低的问题,探讨了不同载体对蛋白可溶表达的影响.利用pET28a进行SinH表达时不能得到可溶的目标蛋白;使用含有泛素标签及内含肽的载体pHUIE实现了卤化酶蛋白SinH的可溶表达,但纯化后纯度不高;利用带有链霉菌分子伴侣蛋白基因的载体pET28a-SinH与pETcoco-pL1SL2在E.coli BL21(DE3)中共表达,在30℃,0.1mmol/L IPTG诱导条件下表达4h,成功获得大量可溶蛋白,使用亲和层析(Ni-NTA)纯化,获得了较纯的目标蛋白SinH,上述研究结果为在大肠杆菌中进行其他链霉菌蛋白的可溶表达提供了参考.

微生物卤代酶研究进展

迄今为止,已经发现了近3800种卤化物,其中很多是重要的抗生素。对这些抗生素的卤化机制的研究发现了四类负责生物卤化的卤代酶。本文综述了这四类卤代酶的特点,并介绍利用卤代酶基因为探针发现海洋放线菌中新抗生素生物合成基因簇的研究进展。

FADH_2-依赖型卤化酶阳性放线菌1076的筛选、分类鉴定及其代谢产物的结构研究

目的筛选FADH2-卤化酶阳性菌株发现天然卤化物。方法设计新的简并引物对200株放线菌基因组卤化酶基因扩增以筛选阳性菌株,并进行比对分析;对阳性菌株进行分类鉴定,对其代谢产物进行HPLC-MS分析。结果筛选得到到51株阳性菌,其中一株与恩拉霉素的同源性为99%。对该编号为1076的菌株进行的分类鉴定结果,确定为Streptomyces macrosporeus。对其代谢产物进行的HPLC-MS分析显示,其代谢产物与恩拉霉素同质。结论卤化酶阳性菌株1076属于S.macrosporeus的一个菌株,是新的恩拉霉素产生菌。

新型核苷碱基卤化酶AcmX的原核表达和结晶

在链霉菌中发现了一类能对核苷碱基进行特异位点卤化修饰的新型卤化酶,通过表达纯化新型卤化酶的活性蛋白、制备蛋白晶体,可对其进行蛋白结构的解析,揭示生物催化卤化反应的机理.在大肠杆菌直接原核表达AcmX,只能得到没有活性的AcmX的蛋白包涵体.借助分子伴侣的表达质粒pGro7,构建AcmX、分子伴侣的共表达系统,发现在30℃,0.5mM IPTG和0.3g/L阿拉伯糖诱导表达3h,可避免目标蛋白AcmX包涵体的形成,并得到足够表达量的目标蛋白,通过高分辨率的分子筛凝胶层析步骤,可去除混入AcmX样品的分子伴侣蛋白GroEL,得到可以用于结晶实验的高均一性的活性AcmX蛋白样品.

色氨酸卤化酶研究进展

能催化卤代反应的卤化酶,因其具有高效、选择性好、反应条件温和的特点受到广泛关注。其中色氨酸卤化酶是研究最多的一类酶,它的特点是可以有选择性地卤化色氨酸,主要包括氯化和溴化。而卤代化合物具有多种生物活性,在医药、化工等领域有着广泛的应用。本文主要介绍了色氨酸卤化酶的来源和种类,酶学性质及其异源表达的研究现状;重点阐述了其结构和功能之间的相互关系及催化机理;并对色氨酸卤化酶的应用以及未来发展方向进行了展望,以期为色氨酸卤化酶的开发应用提供参考。

黄素依赖型卤化酶的研究进展及应用

卤化物在医药化工领域有着不可替代的地位,然而传统的有机化学卤代反应因其严苛的反应条件和高毒性而限制了推广应用。随着生物化学中酶反应的发展,卤代酶以高效率条件温和的特点被逐渐重视起来。在已发现的各类不同种类以及各样作用机理的卤代酶中,黄素依赖型卤代酶(flavin-dependent halogenases)具有良好的底物特异性以及稳定的催化位点选择性。而通过对蛋白结构的研究以及突变改进酶的特性,这类卤代酶被证明可以用于工业生产以及药物开发。尽管目前对于黄素依赖型的研究正处于起步阶段,但其广泛的分布性以及稳定可控的特性给未来的应用带来光明的前景。

来源卤化二型聚酮类生物合成基因簇的两种关键功能基因鉴定与表达

为催化卤化产物,挖掘具有生物活性的新卤化物提供新的方法途径,拟构建卤化酶原核表达载体催化天然卤化物的卤化过程。对链霉菌Streptomyces sp.FJS31-2基因组中一个II型PKS类产物zunyimycin生物合成基因簇进行系列分析,针对其中的后修饰酶卤化酶基因和单加氧酶基因进行原核表达纯化。通过分子生物学手段成功构建卤化酶基因(65 kD)和单加氧酶基因(37 kD)的原核表达载体,并对其进行鉴定。卤化酶和单加氧酶在催化化合物的卤化过程中,会产生疑似新卤化产物。

Construction of High Expression Plasmid of Human Augmenter of Liver Regeneration(hALR), Expression and Purification of hALR

Experimental evidence has been presented to suggest that the human augmenter of liver regeneration （hALR） serves as a hepatotruphic growth factor during liver regeneration and as a generalized growth factor during pancreas transplant/regeneration. A prokaryotic expression plasmid, pRSET/6his-c-myc-hALR was constructed, by cloning synthesized hALR cDNA into pRSET/6his-c-myc that was improved on the basis of pRSET B by the group. As a result, the protein was highly expressed in E. coli BL21. The recombinant hALR was over 60% of the total protein in E. coli. Its validity was confirmed by means of Western Blotting. The protein was purified by Ni-NTA affinity chrumatography and this FAD-dependent sulthydryl oxidase activity was measured.

缬草放线菌中卤代酶类抗生素的筛选及遗传转化系统的建立

目的:从基因水平上挖掘新的卤代酶类抗生素。方法:利用简并引物快速筛选缬草放线菌中含卤代酶类抗生素的目标菌株,并对其进行鉴定。选择萘啶酮酸、氯霉素、潮霉素、卡那霉素、红霉素、庆大霉素、阿普霉素等7种抗生素进行抗生素敏感试验,选择目标菌株的最适抗生素及其最适浓度,构建遗传转化系统。结果:从145株缬草放线菌中筛选到1株含卤代酶类抗生素生物合成基因的菌株AJ56,经鉴定其为链霉菌,在最适抗生素萘啶酮酸和阿普霉素的培养基中构建遗传转化系统,经多次传代,成功构建了菌株AJ56与大肠杆菌S17-1/pSET152遗传转化系统。结论:菌株AJ56遗传转化系统的成功构建为进一步研究其次级代谢产物提供了基础。

黄素依赖型溴化酶XanJ参与黄单胞菌菌黄素的生物合成

黄单胞菌属病原菌能侵染约400种植物,造成严重的经济损失。黄单胞菌的一个重要特征是产生具有保护功能的菌黄素。菌黄素是一类含有两个溴修饰的芳香多烯类磷脂化合物,但负责溴修饰的基因及其溴化机理还不清楚。本研究以野油菜黄单胞菌XC1菌株和稻黄单胞菌PXO99A菌株菌黄素生物合成基因簇中的xanJ为研究对象,开展了生物信息学、遗传学、生物化学和病理学等方面的探究,初步阐明了xanJ的生物学功能。XanJ含有一个FAD结合结构域或一个色氨酸卤化酶结构域,拥有高度保守基序GXGXXG和WXWXIP,属于一类FAD依赖型卤化酶;xanJ敲除突变体无法合成双溴菌黄素,但仍能合成少量无溴化修饰的菌黄素;xanJ突变体中菌黄素前体3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸无积累;在xanJ突变体中过表达已知的酚类卤化酶基因ab10、bmp5、aerJ和mcnD无法恢复双溴菌黄素的生物合成;敲除xanJ不影响病原菌的胞外纤维素酶﹑胞外蛋白酶和胞外多糖的生物合成,也不影响对甘蓝的致病性。因此,XanJ可能负责菌黄素多烯链上β-碳原子的溴化,并参与菌黄素生物合成过程中的多烯链延伸。

北极海洋链霉菌604F的卤化酶基因克隆及特征

【目的】本研究旨在克隆来自北极海洋、具有合成卤化物潜力的链霉菌(Streptomyces sp.)604F中的一个卤化酶基因,为后续克隆卤化物合成基因簇、分离鉴定卤化物提供指导。【方法】利用琼脂块法初步测试抗菌活性,借助液相色谱-飞行时间串联质谱技术(LC-Tof MS)初步寻找Streptomyces sp.604F发酵粗提液中的卤化物,并以简并PCR扩增合成次级代谢产物的指示基因(I型、II型聚酮合酶及非核糖体多肽合成酶编码基因);根据依赖黄素腺嘌呤二核苷酸的卤化酶基因保守区设计的简并引物,扩增基因片段并测序分析;采用高效热不对称交错PCR(hiTAIL-PCR)技术扩增卤化酶基因全长。【结果】Streptomyces sp.604F具有较强的抗白色念珠菌活性,其基因组同时含有编码I型聚酮合酶、II型聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因,以及卤化酶基因;通过染色体步移克隆该卤化酶基因全长,共1443 bp,编码一个新的非色氨酸卤化酶,在合成已知卤化物的卤化酶数据库中,与其同源关系最近的为一类参与合成糖肽类次级代谢产物的卤化酶。【结论】Streptomyces sp.604F具有新的非色氨酸卤化酶,且推测参与糖肽类化合物的卤化修饰,为后续寻找目的卤化物提供了指导,也为研究该合成基因簇奠定基础。

不同生境放线菌的卤化酶基因分析及其对卤代产物筛选的意义

【目的】在基因水平上分析并比较陆地来源与海洋来源的放线菌产生卤化代谢产物的潜力。【方法】基于依赖黄素腺嘌呤二核苷酸的卤化酶基因筛选,从经过表型去重复的70株陆地来源和71株海洋来源的放线菌中,通过PCR筛选获得卤化酶基因片段,并进行测序鉴定;通过卤化酶氨基酸序列的系统发育分析,比较不同来源放线菌的卤化酶序列,以及海洋链霉菌和小单孢菌的卤化酶序列。另外,对卤化酶阳性菌株进行了聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的检测。【结果】本研究中36.6%的海洋放线菌具有卤化酶基因,其阳性率远高于本研究所涉及的陆地放线菌(14.3%);其中海洋链霉菌的卤化酶基因阳性率高达69.0%,而海洋小单孢菌的卤化酶阳性率仅为14.3%。86.1%的卤化酶阳性菌株具有聚酮合酶和/或非核糖体多肽合成酶基因。本研究获得的海洋来源的卤化酶序列与已知的卤化酶序列存在明显差异,在进化树上形成几个新的分支;其中链霉菌间的卤化酶序列相似性较高,而小单孢菌间的卤化酶序列差异较大。【结论】海洋来源的放线菌,尤其是海洋链霉菌,可作为未来获得新卤化活性物质的一类重要微生物资源。

卤代酶与生物卤化反应进展

卤化物在生物圈内广泛存在,许多天然卤化物广泛应用在药理学领域。根据催化机理,催化形成C-X键的卤代酶(halogenases)主要分为两大类型:卤代过氧化物酶(haloperoxidases)和黄素依赖型卤代酶(flavin-dependent halogenases),另外还有非血红素Fe(Ⅱ)/α-酮戊二酸盐依赖型卤代酶(non-heme FeⅡ/α-keto-glutarate(aKG)-dependent halogenases)、甲基卤代转移酶(methyl halide transferases)和氟化酶(fluorinases)等。本文综述了目前已知的卤代酶的发现、分子作用机制和生物催化潜力。近年来,卤代酶在生物卤化过程中的重要生物学功能已经引起了广泛关注。利用组合生物合成、定向进化等现代生物技术合成有价值的天然卤代衍生物将有广阔的应用前景。