牛FADD基因的克隆分析及其真核表达载体的构建

【目的】克隆牛FADD基因并构建真核表达载体,以探讨其在牛卵泡发育过程中的调控作用。【方法】采用RT-PCR技术,从牛卵巢组织总RNA中反转录FADD cDNA,对编码区核苷酸序列分析后,将其全长cDNA删除终止密码子,采用定向克隆技术连接克隆到含有水母绿色荧光蛋白(AcGFP)报告基因的真核表达载体pAcGFP-Nl中,用BglⅡ、EcoRⅠ双酶切、测序进行鉴定,并进行了牛FADD mRNA的组织表达谱分析。【结果】克隆的牛FADD基因编码区全长序列与NCBI公布的序列完全一致,核苷酸和氨基酸序列与猪的同源性最高,与鸡的同源性最低,仅为42.5%和44%;通过PCR方法在FADD阅读框两端引入了BglⅡ和EcoRⅠ克隆位点,并于起始位点前加入Kozak序列,成功构建pAcGFP-N1-bFADD融合蛋白表达载体。组织表达谱分析表明,牛FADD mRNA高表达于肝脏、淋巴组织及睾丸、卵巢组织,在小肠、心、胰腺、肺、肾及肌肉中则弱表达或无表达。【结论】成功克隆了牛FADD基因,并构建pAcGFP-N1-bFADD融合蛋白表达载体,为FADD基因在牛卵母细胞发育调控中的基础研究提供了一种简便可靠的方法。

非小细胞肺癌组织中FADD基因的表达及突变分析

背景与目的:Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associateddeathdomain,FADD)是细胞凋亡信号转导过程中重要的转接蛋白,研究表明其异常表达可能与肿瘤关系密切,但有关FADD与人非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)的研究尚鲜见报道。本研究检测FADD基因在NSCLC中的表达及突变情况,以探讨该基因在肺癌发生发展中的作用及机制。方法:采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(polymerasechainreactionandsingle-strandconformationpolymorphism,PCR-SSCP)以及免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)分别检测62例NSCLC及13例癌旁非癌肺组织中FADD基因突变及蛋白表达情况,原位杂交法(insituhybridization,ISH)检测其中30例肺癌组织FADDmRNA表达水平,原位末端标记法(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTP-biotinnicklabeling,TUNEL)检测62例NSCLC中的癌细胞凋亡。结果:PCR-SSCP检出62例NSCLC组织中有4例N2期组织发生FADD基因突变,提示FADD基因突变与淋巴结转移有关。IHC结果显示:NSCLC组织中FADD蛋白阳性率为80.6%(50/62),其阳性表达程度与肿瘤分化程度呈显著正相关(rs=0.411,P<0.01),癌组织中FADD阳性表达程度高于癌旁非癌肺组织(P<0.05)。

PCR-SSCP法检测非小细胞肺癌中FADD基因突变的研究

目的检测Fas相关死亡结构域蛋白(Fasassociateddeathdomainprotein,FADD)基因在人非小细胞肺癌(nonsmallcelllungcancer,NSCLC)中的突变情况,以探讨该基因在肺癌发生发展中的作用及机制。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(polymerasechainreactionandsinglestrandconformationpolymorphism,PCRSSCP)检测74例NSCLC原发灶癌组织及13例癌旁正常肺组织中FADD基因突变情况。结果74例NSCLC组织中检出5例发生FADD基因突变,FADD基因突变与癌的淋巴结转移呈显著正相关(rs=0.378,P=0.001),与其他临床病理特征无关。结论NSCLC中存在着FADD基因突变。FADD基因突变在NSCLC的发生发展中可能起着重要作用。

脂肪酸Bacillus pumilus羟基化调控基因fadD-like的克隆与序列分析

利用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的ω-1-羟基脂肪酸高产突变菌株M-F641、M-F81、M-F8272及B.pumilus20075的总DNA为模板,通过Primer Premier5.0软件设计引物,对决定长链脂肪酸无效降解途径中的关键酶基因fadD-like基因进行克隆,得到4条长约1 720 bp的fadD-like基因全序列;利用MEGA3.1、DNAStar等软件进行序列分析结合脂酰辅酶A合成酶系统进化分析,结果表明其与fadD基因具有较高的相似性,克隆得到的核苷酸为编码脂酰辅酶A合成酶的fadD基因序列;研究结果为长链脂肪酸高效转化生产ω-1-羟基脂肪酸提供基础。

人FADD基因诱导粘液表皮样癌细胞凋亡的研究

目的 观察人FADD基因对涎腺粘液表皮样癌细胞 (MEC - 1)的诱导凋亡作用。方法 通过反转录PCR获取人FADD基因 ,将基因克隆入绿色荧光蛋白真核表达载体pIRES2 -EGFP中 ,阳离子脂质体法转染粘液表皮样癌细胞 ,通过细胞记数、荧光显微镜及电镜观察、流式细胞仪等检测被转染细胞的生长及其凋亡状况。结果 与对照组相比 ,在转染 1～ 3天内 ,FADD基因的表达导致粘液表皮样癌细胞存活数目减少 ,大量细胞发生凋亡。结论 人FADD基因可以有效地诱导转染的粘液表皮样癌细胞凋亡。

白氏文昌鱼FADD的克隆及功能研究

Fas死亡结构域相关蛋白(Fas-associated death domain protein,FADD)是死亡信号转导通路中的连接蛋白,在脊椎动物中其结构和功能都很保守。本文首次克隆了头索动物白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)FADD(bbFADD)的cDNA和基因组DNA序列。bbFADDcDNA全长1239 bp,编码217个氨基酸。与脊椎动物的FADD一样,bbFADD含有N端的死亡效应结构域(Death Effector Domain,DED)和C端的死亡结构域(Death Domain,DD)。bbFADD氨基酸序列的第33位氨基酸苯丙氨酸在进化过程中相对保守,此苯丙氨酸在FADD自我相互作用中具有重要作用。哺乳类的FADD基因编码区含有两个外显子,而bbFADD基因含有3个外显子。一般认为头索动物处在无脊椎动物进化到脊椎动物的中间过渡阶段,但基于FADD氨基酸序列的系统进化树和同源性分析显示,文昌鱼与海胆的亲缘关系更近。bbFADD在HeLa细胞中超表达能够引起HeLa细胞的凋亡,暗示bbFADD可能能够在人类细胞凋亡通路中起作用,推测凋亡系统在生物进化过程中相当保守。

牦牛死亡结构域蛋白(FADD)基因克隆与生物信息学分析

死亡结构域蛋白(FADD)是在生物细胞里起到信号转导作用的一种蛋白,在胚胎发育、细胞凋亡过程中发挥重要的生物学活性。实验以成年母牦牛的卵巢RNA为模板,利用RT-PCR技术克隆牦牛FADD基因,并进行了生物信息学分析。结果表明:牦牛FADD基因CDS区长度630 bp,编码209个氨基酸,蛋白分子式C996H1632N300O307S7,整个蛋白质带负电荷,总共原子数量3 242;分子质量23.0 ku,半衰期30 h;理论等电点6.11;消光系数18 240;不稳定指数49.08,属于不稳定蛋白;脂肪系数104.64,平均亲水系数-0.168,预测FADD蛋白为亲水蛋白。系统进化树表明,牦牛与哺乳动物亲缘关系近,与鱼亲缘关系最远,符合物种进化规律。FADD蛋白质的二级结构α螺旋、自由卷曲、β-转角和延伸链,占靶蛋白的比例分别为71.29%、22.97%、3.83%和1.91%,与三级结构相符。牦牛FADD蛋白有13.0%位于细胞核、52.2%位于细胞质、8.7%位于细胞外、13.0%位于线粒体、4.3%位于高尔基体和8.7%位于细胞骨架。该研究成功克隆出牦牛FADD基因CDS区,为进一步研究其功能提供了一定理论依据。

中药复方“金复康”抑制肺癌细胞生长机制的研究

目的:本文主要探讨中药复方金复康萃取物对人非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)A549细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法:本文以人非小细胞肺癌A549细胞为研究对象,应用CCK8试剂盒检测了金复康萃取物对细胞增殖活力的影响,流式细胞技术检测金复康对细胞凋亡诱导作用,实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(Real-time q PCR,RT-q PCR)检测细胞凋亡相关基因的表达。结果:金复康萃取物对A549细胞增殖有较显著抑制作用,并且存在剂量依赖效应。与对照组相比,金复康处理组细胞数量明显减少,伴随着大量细胞间距增大,失去原有形态,DAPI细胞核染色结果显示细胞核受到损伤。流式细胞检测实验显示金复康明显诱导A549细胞凋亡。RT-q PCR检测发现金复康上调凋亡相关基因转录表达水平。结论:金复康通过诱导细胞凋亡抑制A549细胞增殖,这一过程可能与其诱导凋亡相关基因FADD和GADD45a表达上调有关。

Fas相关死亡域蛋白在增生性瘢痕组织中原位表达及意义

目的探讨Fas相关死亡域蛋白(FADD)在增生性瘢痕(HS)各个时期的表达变化以及与HS演变的关系。方法采用原位杂交与图像分析系统相结合的方法,定量观察FADD在HS各个时期的表达变化。结果FADD在HS成熟期的表达量是增殖期的2倍,是消退期的5倍;FADD阳性信号主要见于表皮棘层、真皮网状层,以及部分血管。结论FADD表达与增生性瘢痕演变密切相关。

四妙散调节软骨细胞凋亡与自噬治疗膝骨关节炎大鼠的实验研究

目的:通过膝骨关节炎大鼠模型研究四妙散调节软骨细胞凋亡与自噬治疗膝骨关节炎(KOA)大鼠的作用机制。方法:8周龄SD大鼠27只,随机分为正常对照组、KOA模型组、四妙散组,KOA模型组和四妙散组采用前交叉韧带切除法制作KOA模型,手术6周后四妙散组以四妙散药液灌胃,正常对照组和KOA模型组以生理盐水灌胃。连续灌胃4周后取膝关节软骨组织,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术测定凋亡细胞所占比例,采用荧光定量PCR检测关节软骨组织中凋亡和自噬相关基因表达水平。结果:与正常对照组比较,KOA模型组大鼠关节软骨细胞凋亡率显著升高,关节软骨细胞中凋亡相关蛋白Fadd、Casp3的表达显著升高,自噬相关蛋白LC3的表达显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与KOA模型组比较,四妙散组大鼠关节软骨细胞凋亡率显著降低,关节软骨细胞中凋亡相关蛋白Fadd、Casp3的表达显著降低,自噬相关蛋白LC3的表达显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:软骨细胞凋亡是KOA发病中的重要因素,该凋亡可能通过FADD-CASP3途径发挥作用。软骨细胞自噬作用的激活可抑制细胞凋亡,可能是延缓及控制KOA进展的一个新机制,四妙散可能通过该机制发挥治疗作用。

FADD基因在头颈鳞状细胞癌的预后价值

目的FADD基因是程序性死亡进程中关键基因,在自噬相关基因模型和HPV阳性多生物标志物的联合研究中,FADD在HNSCC研究中的预后价值已经被研究,但其单个基因在HNSCC预后评估中的研究仍需要进一步深入。本项研究旨在研究FADD基因在头颈鳞状细胞癌的预后价值。方法本研究应用GTEx数据库和TCGA数据库中头颈鳞状细胞癌的表达谱文件,提取FADD基因表达水平。根据FADD基因的高、低分组绘制头颈鳞状细胞癌的Kaplan-Meier曲线,单因素COX分析评价FADD基因的高、低分组对头颈鳞状细胞癌总生存期(Overall Survival,OS)、疾病特异性生存期(Disease Specific Survival,DSS)、无进展生存期(Progress Free Survival,PFS)。再应用斯皮尔曼相关分析方法,对FADD基因及该基因突变与头颈鳞状细胞癌的肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性的相关性进行分析。其后应用TCGA portal数据库对头颈部鳞状细胞癌样本数据中FADD基因、年龄、性别、种族、临床分期、肿瘤纯度,与患者的总生存期进行多因素COX分析,进一步分析FADD基因与头颈鳞状细胞癌临床病理参数、免疫细胞之间的关系及FADD基因在头颈鳞状细胞癌中的预后价值。结果FADD基因在头颈鳞状细胞癌组织中表达水平显著高于癌旁正常组织(P<0.05)。FADD基因高、低风险组对头颈鳞状细胞癌的OS、DSS、PFS均都具有显著影响(P<0.05)。FADD基因突变对头颈鳞状细胞癌的微卫星不稳定具有显著影响(P<0.05),并呈正性相关。FADD基因突变对头颈部鳞状细胞癌的肿瘤突变负荷无显著影响(P>0.05)。研究发现头颈部鳞状细胞癌中FADD基因、年龄、肿瘤4期(stageⅣ)是危险因素(P<0.05)。FADD基因水平与头颈鳞状细胞癌中肿瘤免疫浸润细胞静息CD4 T细胞、M0巨噬细胞、中性粒细胞浸润、树突状细胞呈正相关(P<0.05),而与CD8 T细胞、B细胞呈负相关(P<0.05)。结论FADD基因可作为头颈鳞状细胞癌的预后标志物。

工程大肠杆菌高效转化外源脂肪酸生成羟基脂肪酸的研究

细胞色素P450单加氧酶(P450BM3)能特异性催化脂肪酸ω碳位羟基化反应生成羟基脂肪酸,在前期构建携带单加氧酶基因P450BM3工程大肠杆菌(Escherichia coli)转化脂肪酸的基础上,为解决外源脂肪酸在羟基化过程中的消耗和转运问题,构建了脂酰基辅酶A合成酶基因(fadD)缺失和外膜蛋白编码基因(fadL)过表达的工程菌株。摇瓶条件下羟基十二酸产量达到748.8 mg/L,转化率为93.6%。

PCR—SSCP法检测非小细胞肺癌中FADD基因突变的研究

目的：检测Fas相关死亡结构域蛋白（Fas—associated death domain protein，FADD）基因在人非小细胞肺癌（non—small cell lung cancer，NSCLC）中的突变情况，以探讨该基因在肺癌发生发展中的作用及机制。方法：采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析（polymerase chain reaction and single—strand conformation polymorphism，PCR—SSCP）检测74例NSCLC原发灶癌组织及13例癌旁正常肺组织中FADD基因突变情况。结果：74例NSCLC组织中检出5例发生FADD基因突变，FADD基因突变与癌的淋巴结转移呈显著正相关（ri=0．378，P=0．001），与其它临床病理特征无关。结论：NSCLC中存在着FADD基因突变。FADD基因突变在NSCLC的发生发展中可能起着重要作用。

转染不同基因的NIT细胞体外抗细胞毒T细胞杀伤作用

目的研究转染FADD缺失突变体（FADDdel）和WeelHu／GFP的胰岛β细胞株（NIT细胞）抵抗细胞毒T细胞的杀伤作用及其分泌胰岛素与细胞增殖所受的影响。方法采用免疫磁珠法测量转染WeelHu基因的NIT细胞培养上清中的胰岛素水平及观察其增殖速度。将分别转染空载体pUC-pIC、pCMV和转染pFADDdel、pCMV-WeelHu、pCMV-WeelHu／GFP的NIT细胞与活化的淋巴细胞共培养，利用^51Cr释放试验检测淋巴细胞对NIT细胞的杀伤作用。结果转染weelHu基因与未转染的NIT细胞胰岛素的分泌和生长速度没有明显变化（P〉0．05）。转染pCMV-WeelHu／GFP或pCMV-WeelHu的NIT细胞其抗淋巴细胞杀伤能力明显高于转染空载体的NIT细胞（P〈0．01），表达weelHu或WeelHu／GFP融合蛋白的胰岛细胞之间抗凋亡能力差异无统计学意义，转染FADDdel在低剂量效靶比时对胰岛β细胞有一定保护作用（P〈0．05），但在高剂量效靶比时与转染空载体比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论表达WeelHu或FADDdel的胰岛细胞可抵抗T细胞的杀伤，且对胰岛素的分泌及细胞增殖无明显影响。