人抗菌肽FALL-39突变分子的特性和抗菌功能的比较

目的对人抗菌肽FALL-39不同突变分子蛋白的特性及抗菌功能进行初步的比较。方法应用AU-PAGE电泳、RP-HPLC、Om iga蛋白分析软件,比较FALL-39及其突变蛋白FALL-39-Lys24、FALL-39-Lys32、FALL-39-Lys24′32的特性;测定M IC、MEC和MBC值,并比较抗菌作用。结果突变蛋白AU-PAGE电泳迁移速率较快,RP-HPLC出峰时间未见改变,蛋白的亲疏水性、α螺旋结构、抗原性等蛋白特性无明显改变。M IC、MEC和MBC值表明FALL-39突变肽对大肠杆菌和绿脓杆菌的抗菌活性有所增强。结论突变蛋白在增加正电荷的同时,虽未改变蛋白的特性,但抗菌活性增强。

人抗菌肽FALL-39基因定点突变体的构建及其大肠杆菌表达产物的抗菌活性研究

目的 构建人抗菌肽 FAL L - 3 9定点突变子及研究其抗菌活性。方法 采用 PCR体外定点突变技术( PCR- SDM) ,设计两对引物 ,引入一个突变点 ,通过重叠延伸法两次 PCR扩增 ,使 FAL L - 3 9第 3 2位密码子由AAT突变为 AAG,将扩增片段克隆入 PGEXλ1T质粒中 ,转化大肠杆菌 JM10 9,并用 IPTG诱导 ,表达的 FAL L -3 9- lys3 2经纯化后与 FAL L - 3 9进行抗菌活性比较。结果 DNA测序结果表明在预期位点发生突变 ,突变后的FAL L - 3 9- lys3 2蛋白对大肠杆菌 ML - 3 5 p的抗菌活性明显增强 ,其最低抑菌浓度 ( MIC)和最低杀菌浓度 ( MBC)分别由 FAL L - 3 9蛋白的 18.75和 3 7.5 0μg/ m l降低为 FAL L - 3 9- L ys- 3 2的 10 .94和 2 1.88μg/ m l,对绿脓杆菌ATCC2 785 3的 MIC和 MBC值分别为 FAL L - 3 9蛋白的 3 1.2 5和 3 7.5 0μg/ m l降低为 FAL L - 3 9- L ys- 3 2的 18.75和 3 1.2 5μg/ ml。两种蛋白均在含 Medium E的 L B培养基中表现出较高活性 ,在 L B培养基中抗菌活性最低 ,但在同一种培养基中 FAL L - 3 9- L ys- 3 2蛋白抗菌活性要高于 FAL L - 3 9蛋白。结论 用两步 PCR定点突变技术获得一个 FAL L - 3 9- L ys3 2突变子 ,其表达分子的抗菌活性明显增强 ,提示在 FAL L - 3 9分子中增加碱性?

头孢他定与FALL-39用于脓毒血症的疗效

目的观察FALL-39和头孢他定（CFZ）治疗脓毒血症的疗效。方法从pGEX-1λT-FALL-39转染的E.coli JM109中提纯FALL-39，检测FALL-39对绿脓杆菌（PAG）的杀菌活性。采用更生霉素（AMD）增强BALB／c小鼠对PAG感染的敏感性，建立脓毒血症模型，观察FALL-39和CFZ治疗脓毒血症的疗效。结果FALL-39分子量约5kDa，纯化量约600-650μg，对PAG的最低抑菌浓度（MIC）、最低有效浓度（MEC）、最低杀菌浓度（MBC）分别为25、100、50μg／ml。盐水组、脓毒血症组、CFZ治疗组、FALL-39治疗组和CFZ＋FALL-39治疗组小鼠死亡率分别为0％、75％、62．5％、37．5％和12．5％。结论FALL-39治疗脓毒血症比CFZ更为有效，两者联用效果则更佳。

用PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体及其功能的研究

目的 用PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL 3 9基因突变体 ,并比较研究FALL 3 9及其突变肽的功能。方法 采用PCR体外定点突变技术 (PCR SDM ) ,设计一对方向相反的引物 ,其中一个引物引入一个突变点 ,应用高保真的PolybestDNA多聚酶进行含FALL 3 9肽的PGEXλ1T质粒的PCR扩增 ,使FALL 3 9第 2 4位密码子由CAG变为AAG ,将扩增片段自身连接后克隆入工程菌JM 10 9中表达其突变肽 (FALL 3 9 lys2 4) ,纯化后与FALL 3 9进行抗菌活性比较。结果 DNA测序结果表明在预期位点发生突变 ,突变后FALL 3 9 lys2 4抗菌活性增强 ,在抗菌剂量时对红细胞的溶解作用未见明显增加 ,较大剂量时对红细胞的溶解作用略有增加。结论 用高保真的PolybestDNA多聚酶进行PCR定点突变技术简单、有效 ,获得一个FALL 3 9 Lys2 4突变子 ;其表达分子的抗菌活性明显增强 ,对红细胞的溶解作用在抗菌剂量时未见明显增加 ,较大剂量时略有增加 ,这些结果提示在FALL 3 9分子中增加碱性氨基酸可以增强其抗菌活性 ,但必须注意避免溶血的副作用。

抗菌肽FALL-39及其突变肽对诱生型一氧化氮产生的影响

目的:比较人抗菌肽FALL-39及其突变肽对细菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)介导的诱生型一氧化氮(nitric oxide,NO)产生的影响。方法:体外常规培养人单核吞噬细胞THP-1,LPS刺激细胞,分别用人抗菌肽FALL-39以及突变肽FALL-39-Lys24,FALL-39-Lys32,FALL-39-Lys24′32处理细胞。应用RT-PCR方法测定LPS诱生型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase,iNOS)以及FALL-39 mRNA的表达,用硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中NO的含量。小鼠腹腔注射更生霉素和LPS建立内毒素血症模型,分别用抗菌肽处理动物,取血测定血清中NO的含量。结果:LPS刺激FALL-39 mRNA的表达增加;同时也诱导NO mRNA的表达以及细胞培养上清液中NO含量的增加。人抗菌肽FALL-39及其突变肽FALL-39-Lys24,FALL-39-Lys32,FALL-39-Lys24′32可以抑制LPS诱导的NO的产生;其中FALL-39-Lys24′32的抑制作用最为明显。结论:抗菌肽FALL-39及其突变肽具有抗内毒素作用,其机制与抑制LPS诱导的NO产生有关。

卡介苗对人肺腺上皮细胞表达Fall-39 mRNA及抗菌活性的影响

目的 探讨卡介苗能否增强 Fall- 39在人肺腺上皮 SPC- A- 1细胞中的表达 ,分离鉴定卡介苗刺激作用的有效胞壁蛋白组份 ,并检测其抗菌活性。方法 根据 Gen Bank中人 Fall- 39的 c DNA序列资料 ,设计特异性引物 ,应用 RT- PCR法检测 SPC- A - 1细胞 Fall- 39m RNA的表达 ,采用超声破碎细胞、蔗糖密度梯度离心、SephadexG- 75柱层析等方法分离卡介苗胞壁蛋白质组份 ;采用琼脂糖弥散杀菌法检测 SPC- A- 1细胞培养上清的抗菌活性。结果 卡介苗刺激 SPC- A - 1细胞 Fall- 39m RNA的表达明显增强 ,而且这种诱导增强表达在一定范围内具有刺激物剂量和时间依赖性。卡介苗胞壁蛋白层析所得 6个组份中 ,组份 4 (相对分子质量范围约 2 1～ 2 9× 10 3)诱导 SPC-A- 1细胞 Fall- 39m RNA的表达增强约 8.5倍 ,其培养上清的抗菌活性显著增强。结论 BCG胞壁蛋白是 Fall- 39基因的激活因子 。

抗生素肽FALL-39基因大肠杆菌表达载体的构建

细菌对传统抗生素产生耐药性是当今临床医学中的全球性难题之一。内源性抗生素肽是多细胞生物天然进化产生的抵御外源性感染的生物活性肽，历经数百万年而无耐受产生，且其作用迅速、强力、广谱。但是天然获取、固相合成和重组真核表达抗生素肽量少而造价极其昂贵，因此，利用微生物作为生物反应器通过基因工程技术生产抗菌肽，是进行抗菌肽研究开发的最有前途的选择之一。

用PCR定点突变方法研究人抗菌肽FALL-39功能与结构的关系

目的：构建人抗菌肽FALL-39的原核表达系统，解决抗菌肽获取困难的难题；用：PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体，并比较研究FALL-39及其突变肽的功能：方法：应用RT-PCR从人肺腺上皮细胞株SPC-A-1总RNA中扩增FALL-39成熟肽cDNA，以pGEX-1λT为载体，构建抗菌肽FALL-39基因大肠杆菌表达载体；采用一步法和两步法PCR体外定点突变技术，用赖氨酸替代第24位的谷氨酰胺和／或第32位的天门冬氨酸，构建FALL-39突变体大肠杆菌表达载体；该载体表达的融合蛋白经亲合层析、凝血酶酶切、胶回收和高效液相色谱分离纯化，获得高度纯化的重组FALL-39以及突变肽；对纯化产物进行的：MEC、MIC、MBC和溶血性实验等比较抗菌作用以及对红细胞膜的溶解性，用RT-PCR测定人单核巨噬细胞株THP-1：iNOS的表达，研究FALL-39及其突变肽的抗内毒作用。结果：重组质粒pGEX-1λT-FALL-39测序结果说明其插入片段序列与GenBank登录的FALL-39基因的cDNA序列相符，且插入方向正确；DNA测序结果表明在预期位点发生突变，用一步法得到突变体质粒pGEX-λT-FALL-39-Lys32，用两步法得到pGEX-1λT-FALL-39-Lvs24以及pGEX-λT-FALL-39-Lys24’32；重组原核表达质粒pGEX-λT-FALL-39及其突变体融合蛋白有高效表达，经提取纯化可得到高纯度的活性蛋白FALL-39，FALL-39-Lys24，FALL-39-Lys32和FALL-39-Lys24’32(约4Kd)：突变后的FALL-39蛋白对大肠杆菌ATCC25922和耐氨苄青霉素ML-35p的抗菌活性明显增强，最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)值FALL-39-Lys24’32最小，其次是FALL-39-Lys32和FALL-39-Lys24，均小于FALL-39-FALL-39Lys32和FALL-39两种蛋白均在含：Medium E的LB培养基中表现出较高活性，在LB培养基中抗菌活性最低，但在同一种培养基中FALL-39-Lys32蛋白抗菌活性要高于FALL-39蛋白。突变后FALL-39蛋白在抗菌剂量时对红细胞的溶解作用未见明显增加，较大剂量时对红细胞的溶解作用略有增加。突变后FALL-39-Lys32蛋白对LPS引起的iNOS mRNA的表达量增强抑制作用明显。结论：用FALL-39基因大肠杆菌表达载体可得到高效表达的蛋白；用高保真的Polybest DNA多聚酶进行一步法PCR定点突变技术简单、有效；突变质粒表达分子的抗菌活性和抗内毒素明显增强，对红细胞的溶解作用在抗菌剂量时未见明显增加，较大剂量时略有增加，提示在FALL-39分子中增加碱性氨基酸可以增强其抗菌活性。

河北蓟县常州沟组宇宙尘落地年龄

河北蓟县常州沟组铁质宇宙尘,形状多样,具气印、球粒、壳层和骸晶等多种结构。含钴、富硅、低镍。由磁铁矿、方铁矿、铁纹石、铁橄榄石等矿物组成,属陨石消融型。^(40)As/^(39)Ar阶段加热年龄谱呈单调上升型式,给出1670Ma形成年龄和170Ma热扰动时代。

COSMIC DUST FROM CHANGZHOUGOU FORMATION IN JIXIAN AREA AND ITS FALLING AGE

Ⅰ. GEOLOGICAL SETTINGS OF SAMPLING LOCALITY The sampling locality is in Changzhougou Village on the northern North China Platform. In the late Precambrian, this area seriously sank. Changzhougou Formation overlies unconformably the Archaean gneiss.