FAM92A1-289基因的真核表达载体构建和亚细胞定位

利用PCR方法扩增FAM92A1-289全长,经BamH I和Xho I酶切后连接入pEGFP-N1真核表达载体,构建pEGFP-N1-FAM92A1-289重组表达质粒,转染Hela细胞,利用荧光显微镜观察FAM92A1-289在细胞中的定位。经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的FAM92A1-289读码框。荧光显微镜观察到空质粒pEGFP-N1转染后,整个细胞内弥散绿色荧光,而转染pEGFP-N1-FAM92A1-289重组载体后,可见绿色荧光分布于Hela细胞核中,显示FAM92A1-289定位于细胞核。成功构建人FAM92A1-289真核表达载体,FAM92A1-289定位于哺乳细胞的细胞核中。

FAM92A1-289在不同增殖能力组织及不同周期时相细胞中的表达和意义

目的探讨基因FAM92A1-289在不同增殖能力的组织及不同周期时相细胞中的表达和意义。方法采用血清饥饿法同步化G1期He La细胞,采用胸腺嘧啶核苷双阻断法同步化S期和G2期He La细胞,采用秋水仙素阻断法同步化M期He La细胞;TRIzol一步法提取组织及细胞总RNA;实时荧光定量RT-PCR方法分别检测肝癌组织、癌旁组织、正常脑组织及He La细胞G1期、S期、G2期、M期中新基因FAM92A1-289的mRNA水平,以GAPDH为内参照。结果 FAM92A1-289基因在肝癌组织中有高表达,且肝癌组织比其癌旁组织表达升高,脑组织中表达最低;在He La细胞各周期时相中以S期表达最高,其他各期表达较低。结论 FAM92A1-289基因在增殖旺盛的肝癌组织中表达最高,且主要在细胞周期的DNA复制期表达,表明FAM92A1-289基因的表达水平与细胞增殖有关,此结果为分析FAM92A1-289功能提供了重要线索。

siRNA-FAM92A1-289对HeLa细胞增殖的影响

目的:研究RNA干扰(RNAi)沉默基因FAM92A1-289对HeLa细胞增殖和凋亡的影响。方法:化学合成法合成小干扰RNA(siRNA),阳离子脂质体转染FAM92A1-289 HeLa细胞;实时定量RT-PCR检测其mRNA表达,MTT法和流式细胞仪检测转染后HeLa细胞增殖、细胞周期和凋亡变化。结果:转染合成FAM92A1-289 siRNA后,HeLa细胞中FAM92A1-289 mRNA表达下降(P<0.01),细胞增殖均明显增强(P<0.01);细胞周期分布改变,S期细胞明显增多,而G2/M期细胞减少,凋亡率无变化。结论:FAM92A1-289基因调节细胞增殖活动。

FAM92A1-289表达的宫颈癌HeLa细胞稳转株的构建及其对细胞增殖的影响

目的构建FAM92A1-289表达的宫颈癌He La细胞稳转株,并观察其对宫颈癌细胞增殖的影响。方法构建重组载体CMV-SP6-TALEN-GFP-289,并转染至宫颈癌He La细胞。通过嘌呤霉素筛选得到稳定表达FAM92A1-289的细胞株He La/289,分别用细胞划痕实验、肿瘤球实验、MTT法检测细胞迁移能力、肿瘤生长速度、细胞存活情况。结果成功构建了超表达FAM92A1-289的宫颈癌He La细胞稳定表达株;经检测,其迁移能力更强、生长速度更快、存活率更高。结论成功构建稳定表达FAM92A1-289的细胞株He La/289;FAM92A1-289基因具有促进宫颈癌He La细胞增殖的作用,可作为细胞增殖调节相关基因。

新基因FAM92A1-289与增殖细胞核抗原PCNA相互作用的验证

目的利用免疫共沉淀技术验证未知蛋白FAM92A1-289和PCNA(增殖细胞核抗原)之间的相互作用。方法构建带有嘌呤霉素抗性的载体CMV-SP6--GFP-FAM92A1-289和真核表达载体PCDNA3.1-PCNA,先将CMV-SP6-GFP-FAM92A1-289载体转染入Hela细胞,通过最合适浓度的嘌呤霉素筛选,得到稳定表达FAM92A1-289的Hela/FAM92A1-289细胞,再将载体PCDNA3.1-PCNA转染入Hela/FAM92A1-289细胞,利用免疫共沉淀来验证FAM92A1-289和PCNA之间的相互作用。结果构建的重组表达载体经双酶切、测序鉴定正确,稳定表达株Hela/FAM92A1-289细胞构建成功,PCNA单克隆抗体沉淀蛋白复合物后,用GFP抗体进行Western blot法检测,检测出了GFP-FAM92A1-289蛋白。结论免疫共沉淀证明了FAM92A1-289和PCNA之间存在相互作用。

酵母双杂交技术筛选宫颈癌HeLa细胞cDNA文库中FAM92A1-289关联蛋白

目的应用酵母双杂交技术从宫颈癌He La细胞c DNA文库中筛选FAM92A1-289关联蛋白。方法构建酵母双杂交p GBKT7-FAM92A1-289诱饵载体,转化至酵母AH109感受态细胞中。利用Clontech GAL4酵母双杂交系统筛选He La细胞c DNA文库中与FAM92A1-289相互作用的蛋白质,用营养缺陷型培养基和X-a-Gal双重筛选实验进行筛选,对筛选结果进行生物信息学分析,对克隆重复率较高的蛋白进行回转验证,将β-半乳糖苷酶活性阳性的克隆进行测序并分析。结果成功构建酵母双杂交p GBKT7-FAM92A1-289诱饵载体,可在酵母细胞中正常表达FAM92A1-289,且对酵母细胞无毒性,不存在自激活现象。筛选出在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培养基及含X-a-Gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培养基上均能生长且β-半乳糖苷酶活性阳性的克隆9个。经生物信息学分析发现4种蛋白重复率较高,即增殖细胞核抗原(PCNA)、半乳糖凝集素1(Galectin-1)、内质网高尔基体中间室标记物53(ERGIC-53)、重组人BCL2相关永生基因1(BAG1),并均与FAM92A1-289存在相互作用。结论利用酵母双杂交技术在Hela细胞c DNA文库中成功筛选出与FAM92A1-289相互作用的蛋白,为进一步研究FAM92A1-289的功能提供了新线索。

FAM92A1-289对人脑胶质瘤U251细胞增殖、迁移能力的影响及其与Galectin-1的关系

目的探讨FAM92A1-289对人脑胶质瘤U251细胞增殖、迁移能力的影响及其与半乳糖凝集素1(Galectin-1)的关系。方法将CMV-SP6-TALEN-GFP-289质粒转染至U251细胞中,通过嘌呤霉素筛选得到稳定过表达FAM92A1-289基因的脑胶质瘤U251/289++细胞株。取脑胶质瘤U251/289++细胞作为观察组,未转染质粒的野生型U251细胞作为对照组,采用实时无标记动态细胞分析技术检测两组培养24、48、72、96、120 h的细胞增殖能力(以光密度值表示),采用Transwell小室试验检测两组细胞迁移能力(以穿膜细胞数表示)。构建PCS2-3Flag-Galectin-1质粒,将人脑胶质瘤U251细胞随机分为FAM92A1-289组、Galectin-1组、共转染组及空白对照组,FAM92A1-289组、Galectin-1组均采用Lipofactamine 3000转染法分别转染CMV-SP6-TALEN-GFP-289质粒、PCS2-3Flag-Galectin-1质粒,共转染组同时转染上述两种质粒,空白对照组仅加入Lipofactamine 3000转染试剂。采用免疫共沉淀实验验证FAM92A1-289与Galectin-1是否存在相互作用。结果两组培养24 h光密度值比较差异无统计学意义(P>0.05);观察组培养48、72、96、120 h光密度值均高于对照组(P<0.05或<0.01)。观察组与对照组穿膜细胞数分别为(242.0±11.41)、(65.40±7.92)个,两组比较P<0.01。共转染组抗GFP蛋白相对表达量明显高于FAM92A1-289组、Galectin-1组及空白对照组(P均<0.01)。结论过表达FAM92A1-289可提高人脑胶质瘤U251细胞增殖和迁移能力;FAM92A1-289与Galectin-1之间的相互作用可能为FAM92A1-289调控人脑胶质瘤U251细胞恶性行为的作用机制。

鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区启动子活性鉴定与分析

文章采用基因定点突变和报告基因技术作A/T富集区启动子鉴定和转录调控分析,研究鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区是否具有启动子活性。PromPredict预测分析提示miR-17-92基因簇上游-388^-444 bp处可能是启动子区域。转录因子结合位点分析发现,A/T富集区存在3个E2F1潜在结合位点,分别位于miR-17-92基因簇上游-1 273 bp(结合位点1)、-1 186 bp(结合位点2)和-753 bp(结合位点3)处。报告基因活性分析发现,鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区具有启动子活性,其中miR-17-92基因簇上游-440/-1区域启动子活性最强。共转染分析显示,转录因子E2F1极显著抑制该A/T富集区启动子活性(P<0.01);进一步定点突变分析表明E2F1通过E2F1结合位点1和2抑制A/T富集区启动子活性。报告基因分析发现,与对A/T富集区启动子作用不同,E2F1促进miR-17-92基因簇宿主基因(MIR17HG)启动子活性。文章首次发现鸡miR-17-92基因簇上游存在一个新的转录调控区,对揭示鸡miR-17-92基因簇转录调控具有重要意义。

鸡miR-20a靶基因TP53INP1鉴定

前期研究发现,过表达mi R-17-92基因簇能促进鸡前脂肪细胞增殖,但作用机制尚不清楚。生物信息学分析发现,TP53INP1是mi R-17-92基因簇成员mi R-17-5p和mi R-20a的潜在靶基因,研究采用荧光素酶报告基因技术和基因过表达技术开展该靶基因的验证。结果表明,过表达mi R-17-92基因簇能显著抑制TP53INP1的3'UTR报告基因活性;而转染mi R-20a抑制剂能显著提高TP53INP1的3'UTR报告基因活性。将mi RNA抑制剂分别转染到DF1细胞和鸡前脂肪细胞中,采用real-time RT-PCR方法检测细胞TP53INP1基因表达变化。结果显示,mi R-20a抑制剂能促进TP53INP1表达,TP53INP1是mi R-20a的一个靶基因。

FAM92A1新转录变异体的鉴定及功能研究

目的:对高度保守新基因FAM92A1的变异体进行鉴定和功能分析。方法:利用RT-PCR和序列测定检测FAM92A1基因新的转录变异体;分别构建FAM92A1三个转录变异体的真核表达质粒(pFAM92A1-271,pFAM92A1-251,pFAM92A1-289),转染SKOV3细胞,用MTT、流式细胞仪分析FAM92A1基因各转录本在过表达情况下对细胞增殖及细胞周期的影响;通过构建其融合蛋白表达载体pFAM92A1-EGFP转染细胞,分析其蛋白的亚细胞分布。结果:发现了FAM92A1两个新的转录变异体FAM92A1-251、FAM92A1-289,三者结构相似,都具有保守结构域DUF1208;FAM92A1-271、FAM92A1-251和FAM92A1-289过表达均可抑制细胞增殖,改变周期分布且阻碍细胞由S期进入G2期,形成S期阻滞;FAM92A1-271融合蛋白在细胞中的分布与DNA分布基本一致,主要定位于细胞核。结论:FAM92A1基因存在至少9种转录变异体,参与细胞增殖及细胞周期活动调节,是一与细胞周期活动相关的重要基因。

免疫细胞联合腺病毒Ad205-IL-15对肝癌细胞的杀伤研究

在已有腺病毒Ad205-IL-15的基础上尝试与过继免疫细胞CIK、NK92等联合开展对肝癌细胞的杀伤性研究。首次通过荧光化学发光的原理构建出携带表达萤光素酶报告基因的肝癌细胞系Huh7-Luc、MHCC97H-Luc来检测细胞的存活率。结果表明:免疫细胞联合Ad205-IL-15对Huh7-Luc、MHCC97H-Luc两株肝癌细胞表现出了较高协同杀伤作用。证明将免疫细胞与腺病毒联合可以相互弥补各自治疗的不足之处,提高了抗肿瘤效果。同时,由于操作方便,荧光素酶报告基因测定法也为检测细胞存活率提供了新的技术手段。