Fancm基因敲除小鼠构建及其表型分析

目的构建范可尼贫血通路Fancm基因敲除小鼠,研究Fancm基因缺失对小鼠生理功能,特别是雄性生殖器官的影响。方法采用CRISPR/Cas9技术,获得Fancm基因敲除小鼠。分析FANCM蛋白在野生型和Fancm^-/-小鼠睾丸组织中的表达。统计Fancm^-/-小鼠的出生率、体重、性别比例及子代生育情况,分析血液常规指标。组织形态学研究雄性Fancm^-/-小鼠睾丸生理病理表型。结果敲除Fancm基因ATG区域,获得稳定遗传的C57BL/6背景Fancm^-/-小鼠。Fancm^-/-小鼠睾丸中FANCM蛋白表达完全丢失。Fancm^-/-小鼠无明显的胚胎致死现象,但雌性Fancm-/-小鼠数目显著少于雄性Fancm^-/-小鼠。同窝Fancm^-/-小鼠比较野生型体重无明显区别,部分血常规指标有显著性差异。Fancm^-/-小鼠有明显的生殖能力缺陷。雄性Fancm^-/-小鼠睾丸有显著的发育缺陷,其生精细胞凋亡增加、细胞周期阻滞,影响睾丸发育与精子的生成。结论成功获得稳定遗传C57BL/6背景Fancm^-/-小鼠,Fancm基因参与小鼠的生长发育,特别是雄性生殖器官功能的维持及调控。

范科尼贫血通路FANCM基因纯合突变导致早发性卵巢功能不全的致病机制

目的 探究范科尼贫血(Fanconi anemia, FA)通路中的FANCM(FA complementation group M)基因及其突变在早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)发生中的致病机制。方法 对1例POI患者进行了全外显子组测序,并通过Sanger测序对突变位点进行验证。构建含有野生型和突变型FANCM基因的质粒,分别转染至293T细胞中,转染野生型人类FANCM质粒、突变型人类FANCM质粒、pEGFP-C1空载体质粒的293T细胞分别命名为EGFP FANCM-WT组、EGFP FANCM-MUT组和EGFP组。对于截短蛋白的验证,3组质粒转染48 h后提取细胞蛋白,使用GFP抗体进行验证。对于DNA损伤修复影响的研究,免疫荧光实验在EGFP FANCM-WT组、EGFP FANCM-MUT组293T细胞质粒转染48 h后进行,以研究该突变是否会影响FANCM定位于染色质的能力;利用丝裂霉素C(mitomycin C, MMC)在体外诱导EGFP FANCM-WT组、EGFP FANCM-MUT组293T细胞链间交联(interstrand crosslinks, ICLs)损伤的形成,然后使用γ-H2AX抗体验证其对ICLs损伤修复的影响。结果 在1例近亲婚配家系的POI患者中,我们发现了FANCM基因c.1152-1155del:p.Leu386Valfs*10的纯合突变。Western blot结果表明,该突变导致截短的FANCM蛋白产生。在丝裂霉素C处理后,与EGFP FANCM-WT组相比,EGFP FANCM-MUT组293T细胞中γ-H2AX水平升高(P<0.01)。免疫荧光结果提示,突变FANCM蛋白的细胞定位只存在于细胞质,在细胞核中缺失,突变的FANCM定位于染色质的能力受损。结论 FANCM基因c.1152-1155del:p.Leu386Valfs*10纯合突变导致截短的FANCM蛋白产生,并且影响FANCM蛋白在细胞核的定位,抑制其应对DNA损伤修复的能力,从而引起女性不孕。