瘢痕疙瘩家系Fas基因死亡域突变的实验研究

目的探讨瘢痕疙瘩家系标本中Fas基因(外显子7～9)有无突变以及Fas基因突变在瘢痕疙瘩形成中的意义。方法实验标本来自南方医科大学南方医院整形外科2005年收集的A、B两个瘢痕疙瘩家系。采用PCR及基因测序技术,分别以A家系2例男性患者的瘢痕疙瘩组织为研究对象,以其周围正常皮肤及外周静脉血作为自身对照,其配偶的外周静脉血作为正常对照,并以B家系2例患者(母亲与儿子)的外周静脉血作为不同家系之间的对照,共检测10份标本中Fas基因外显子7～9基因序列。结果10份瘢痕疙瘩家系标本Fas基因的7、8外显子均未发生突变,2例瘢痕疙瘩组织标本均在外显子9编码区的11bp和53bp两个位点上存在单个碱基基因突变或多态性改变。结论瘢痕疙瘩Fas基因死亡域外显子9区段的基因结构异常,极有可能与Fas蛋白的功能改变有关,从而导致局部瘢痕疙瘩形成。

构建fas基因真核表达载体逆转胃癌耐药细胞MDR表型

目的将ｆａｓ基因转导入胃癌耐药细胞，建立高表达ｆａｓ的耐药株，比较转导前后ｆａｓｍＲＮＡ与蛋白的表达水平，观察转导株对化疗药物的敏感性．方法采用分子克隆技术将人ｆａｓ基因的全长ｃＤＮＡ片段插入真核表达载体ｐＢＫＣＭＶ的多克隆位点之间，并借助脂质体将重组表达载体转导入人胃癌多药耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，Ｇ４１８筛选克隆细胞，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ观察ｆａｓ基因的表达，ＭＴＴ法检测转导株对ＶＣＲ，ＣＤＤＰ，５ＦＵ的敏感性．结果成功地构建了真核表达载体ｐＢＫｆａｓ；转导细胞后，从２×１０５细胞中筛选出大约１２０个抗性克隆，转导率大于０５‰，随机挑选２个克隆继续筛选与扩增培养，最终获得了１株稳定的抗性细胞，命名为ｆａｓＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ；杂交结果表明，转导株与非转导株均有ｆａｓ基因的表达，但转导株ｆａｓｍＲＮＡ及其蛋白水平显著高于非转导株；ＭＴＴ实验结果显示，转导株对ＶＣＲ，ＣＤＤＰ，５ＦＵ的敏感性显著升高．结论在胃癌耐药细胞中ｆａｓ基因处于低表达状态．将ｆａｓ基因全长ｃＤＮＡ导入耐药细胞，能有效增强ｆａｓｍＲＮＡ及其蛋白的表达水平，并使耐药细胞对化疗药物的敏感性显著?

填饲鹅肝脏组织中脂肪酸沉积与FAS基因mRNA的表达丰度

【目的】研究不同填饲期肥肝鹅肝脏组织中不同脂肪酸沉积与脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FAS)基因mRNA的表达丰度及相关性。【方法】对200只100日龄青农灰鹅进行填饲,从填饲0 d起,每隔6 d屠宰1次,共6次。每次随机选取10只,每只为1个重复,屠宰测定肥肝重、肝中脂肪含量、各种脂肪酸含量和FAS基因mRNA的表达丰度。【结果】①肥肝重随填饲时间的延长而增加,肝中粗脂肪含量(ether extract,EE)随肝重的增加而增加,以填饲18—24 d鹅的肥肝增重最快(504.67 g/6 d),12—18 d的次之。②肝中饱和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)和单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)的含量随着填饲时间的延长而增加,尤其是在12—18和18—24 d这两个阶段的沉积最为明显,而多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)主要是在填饲后期(18—30 d)沉积;在整个填饲过程中,各种脂肪酸的沉积表现为填饲后期显著大于填饲前期(P<0.05或P<0.01);填饲30 d时沉积量较大的脂肪酸为肉豆蔻酸(C14﹕0)、棕榈酸(C16﹕0)、硬脂酸(C18﹕0)、棕榈油酸(C16﹕1)、油酸(C18﹕1)、二十碳烯酸(C20﹕1)和亚油酸(C18﹕2),每100 g组织中的含量分别为0.6028、17.72、7.25、2.75、37.42、0.3078和0.43 g。③FAS基因mRNA的表达丰度随肝脏增重和脂肪沉积速度的增加呈现出先增加后迅速降低的趋势,填饲24 d时极显著高于其它时期(P<0.01);0—24 d鹅肝脏组织中FAS基因mRNA表达丰度与肥肝重、EE、SFA和MUFA存在极显著正相关(P<0.01),而与PUFA存在弱负相关且差异不显著(P>0.05),30 d时相关性不显著(P>0.05)。【结论】①鹅肝中EE、SFA和MUFA的含量随填饲时间和肝重的增加而增加;填饲18—24 d鹅肝脏增重和EE、SFA和MUFA的沉积速度最快;②FAS基因mRNA的表达对肥肝鹅肝脏中脂肪的沉积具有填饲前、中期快速增加,填饲后期下降的调控作用。

口腔鳞状细胞癌Fas基因表达与细胞凋亡关系的研究

目的 探讨Fas基因mRNA及蛋白表达水平与人口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的关系。方法 应用Northern杂交、双参数流式术 (TUNEL法 )检测人口腔鳞状细胞癌中FasmRNA及蛋白的表达 ,鳞癌细胞的细胞周期与凋亡水平。结果 5例正常口腔黏膜标本中均有FasmRNA及蛋白的表达。在口腔鳞癌组织中 ,FasmRNA及蛋白的表达与口腔鳞癌组织病理学分级有关 (P <0 0 0 5 ) ,与口腔鳞癌组织分化程度和凋亡指数呈正相关。结论 口腔鳞癌中Fas基因的表达与组织病理学分级及细胞凋亡之间关系密切。

携带Fas基因重组腺病毒治疗瘢痕疙瘩的体外研究

目的 应用成功制备的携带人 Fas基因的两种重组腺病毒 ,感染瘢痕疙瘩 (keroid,K)成纤维细胞 (fi-broblasts,FB) ,使其稳定高效地表达以替换原有无功能的 Fas蛋白 ,并恢复正常的重建后 Fas信号传导通道。 方法 腺病毒感染 KFB后 ,检测及比较两种腺病毒转染前后 ,KFB内 Fas蛋白的表达变化、蛋白功能以及细胞增殖 -凋亡状况。 结果 腺病毒感染后的 KFB均能稳定提高 Fas蛋白的表达 ,并且在 Fas单克隆抗体的诱导下可以发生明显的细胞凋亡。 结论 1构建的两种重组腺病毒 Ad- Fas在体外实验中能有效地提高 KFB蛋白的表达 ,并可以重建原来阻断的死亡信号传导通道 ;2细菌内重组腺病毒体外治疗效果更佳 ;3再次估证了 Fas基因突变与 K之间的联系 ,为 K基因治疗展示了一条新途径。

胆碱对鹅体内脂质代谢及肝脏FAS基因mRNA表达的影响

【目的】探讨胆碱对青农灰鹅体内脂质转运、代谢的作用及脂肪酸合成酶FAS(fatty acid synthase)基因表达的影响,确定鹅日粮中胆碱的最适添加量。【方法】将180只1日龄青农灰鹅随机分为6个处理组,每处理组3个重复,每个重复10只。试验在玉米-豆粕型饲粮的基础上各组的胆碱添加量分别为0、600、1 200、1 800、2 400和3 000 mg.kg-1,试验期15周。屠宰后测定肝脏和血清总胆固醇、甘油三酯,血清低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、葡萄糖、胰岛素、胰高血糖素水平,肝脏脂蛋白酯酶、肝脂酶及血清胆碱酯酶活性和肝脏脂肪酸合成酶(FAS)基因表达量。【结果】①4周龄时,饲粮中添加胆碱显著降低肝脏和血清总胆固醇、甘油三酯、血清低密度脂蛋白胆固醇、胰岛素水平和血清胆碱酯酶活性(P<0.05或P<0.01);显著提高肝脏脂蛋白酯酶、肝脂酶活性和血清胰高血糖素水平(P<0.05);但对血清高密度脂蛋白胆固醇、葡萄糖含量影响不显著(P>0.05)。15周龄时,饲粮中添加胆碱显著降低肝脏和血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇含量与胰岛素水平及血清胆碱酯酶活性(P<0.05或P<0.01);显著提高肝脏脂蛋白酯酶、肝脂酶活性和血清高密度脂蛋白胆固醇、胰高血糖素水平(P<0.05);但对血清葡萄糖含量影响不显著(P>0.05)。②饲粮中添加胆碱显著提高肝脏FAS基因的表达量(P<0.01),且肝脏脂肪酸合成酶基因表达量随胆碱添加水平呈先下降后上升趋势。【结论】综合考虑胆碱对鹅肝脏脂质代谢的影响,1—4和5—15周龄鹅饲粮中胆碱适宜添加量分别为1 200—1 800和1 200 mg.kg-1。

阿仑膦酸盐诱导破骨细胞凋亡FAS基因的表达

本研究采用１０－８Ｍ１，２５（ＯＨ）２Ｄ３诱导ＳＤ鼠骨髓细胞形成破骨细胞，通过检测细胞上ＦＡＳ基因的表达，探讨骨吸收因子阿仑膦酸盐的作用机制。骨髓细胞培养６天即有多核巨细胞形成，加入阿仑膦酸盐致终浓度为１００μＭ，继续培养４８小时后，发现用药组破骨样细胞及圆形单核细胞的前体细胞呈现凋亡的形态学特征：胞浆收缩，核固缩等。ＦＡＳ抗原是与细胞凋亡密切相关的细胞表面蛋白，用抗ＦＡＳ抗体免疫组化方法，检测凋亡的破骨细胞及其前体细胞上ＦＡＳ基因的表达，结果呈阳性，而未凋亡细胞呈阴性，提示阿仑膦酸盐导致的破骨细胞及其前体细胞的凋亡。

FAS基因突变导致自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)一例

目的探讨1例FAS基因突变导致ALPS的临床特征、基因变异及其蛋白表达水平。方法患儿为男性,婴幼儿期起病,慢性、非恶性淋巴结和肝脾肿大,伴自身免疫性溶血性贫血、血小板减少及粒细胞减少。采用流式细胞仪检测双阴性T淋巴细胞和FAS蛋白表达。采用PCR方法扩增患儿及父母FAS基因组DNA。采用RT-PCR扩增患儿及父母FAS mRNA。PCR产物直接进行双向序列测定及FAS突变基因表达频率测定。结果患儿CD3+CD4-CD8-TCRαβ+T细胞12.68%,T淋巴细胞上FAS蛋白的表达为9.96%,较正常对照降低。基因检测为患儿FAS基因4号外显子93位碱基错义突变(T>A),导致FAS蛋白第143位氨基酸由丝氨酸替换为半胱氨酸(Ser14Cys),其父为携带者。患儿FAS基因突变基因表达频率为95%,其父为60%。结论经临床、免疫学筛查和基因分析,患儿可诊为ALPS(g:18451T>A c:773T>A Ser143Cys),突变基因表达的频率可能影响疾病外显率。

帕金森病多巴胺细胞凋亡与Fas基因表达的机制研究

目的探讨Fas基因mRNA抑制后对帕金森病(PD)大鼠模型中多巴胺细胞的抗细胞凋亡作用。方法将75只SD大鼠按随机数字表法分为五组,每组15只。空白对照组:大鼠脑黑质内注入生理盐水;PD组:脑黑质内注射6-OHDA;Fas siRNA组:脑黑质内注射Fas基因抑制剂Fas siRNA,2 d后注射同剂量的6-OHDA;阳性对照组及阴性对照组:脑黑质内分别注射Fas siRNA阳性对照物、阴性对照物,2 d后注射同剂量的6-OHDA。采用免疫组化、聚合酶链反应和蛋白印迹杂交技术检测多巴胺阳性细胞数、Fas-mRNA及Fas-蛋白相对表达量。结果PD组大鼠的TH阳性细胞计数少于空白对照组(P<0.05);Fas siRNA组和阳性对照组大鼠的TH阳性细胞计数多于PD组(P<0.05);大鼠的TH阳性细胞计数多于阴性对照组(P<0.05)。PD组大鼠的Fas-mRNA及Fas-蛋白相对表达量均高于空白对照组(P<0.05);Fas siRNA组和阳性对照组大鼠的Fas-mRNA及Fas-蛋白相对表达量均低于PD组(P<0.05);Fas siRNA组和阳性对照组大鼠的Fas-mRNA及Fas-蛋白相对表达量均低于阴性对照组(P<0.05)。结论Fas基因的表达被抑制后可有效减少多巴胺细胞的凋亡。

吡那地尔对大鼠心肌缺血/再灌注时细胞凋亡及fas基因表达的影响

目的 探讨 ATP敏感性钾通道 (KATP)开放剂吡那地尔对大鼠心肌缺血 /再灌注时心肌细胞凋亡及 fas基因蛋白表达的调节作用 .方法 4 0只大鼠随机分成 4组 :1假手术组 (仅穿线而不结扎 ,观察 6 .5 h) ;2缺血 /再灌注组(缺血 30 min,再灌注 6 h) ;3吡那地尔组 (缺血前 10 m in静推吡那地尔 0 .2 mg· kg- 1 ,然后缺血 30 min/再灌注 6 h) ;4吡那地尔 +优降糖组 (缺血前 10 min静推吡那地尔 0 .2 m g·kg- 1 +优降糖 3mg·kg- 1 ,然后缺血 30 min/再灌注 6 h) .称质量法计算心肌梗死范围 ,以缺口末端标记法 (TUNEL)检测凋亡细胞 ,以 SABC免疫组化法检测 fas蛋白的表达 .结果 缺血 /再灌注组出现显著的心肌细胞凋亡 ,伴有 fas蛋白表达指数升高 (P<0 .0 1vs假手术组 ) ;吡那地尔可抑制心肌细胞凋亡 ,并显著下调 fas蛋白的表达 (P<0 .0 5 ) ,而优降糖可取消吡那地尔的作用 .结论 细胞凋亡及 fas基因表达改变参与了心肌缺血 /再灌注损伤过程 ,KATP开放剂 (吡那地尔 )可抑制心肌细胞凋亡、下调 fas基因的蛋白表达 .

巴豆生物碱对人胃腺癌细胞SGC-7901Fas基因表达影响的研究

目的:研究巴豆生物碱对人胃腺癌细胞SGC-7901Fas基因表达的影响。方法:应用流式细胞术检测Fas基因的表达。结果:巴豆生物碱中、大剂量组能明显诱导人胃腺癌细胞SGC-7901Fas基因的表达。结论:巴豆生物碱具有诱导人胃腺细胞SGC-7901分化作用。

胃癌前组织和胃癌中Fas基因表达及其与细胞凋亡的关系

目的 探讨胃癌前组织及胃癌中Fas基因表达状况及其与细胞凋亡的关系。方法 应用原位杂交和免疫组织化学技术检测 10例正常胃粘膜、72例慢性胃炎和 5 3例胃癌中Fas基因的表达 ,并采用凋亡细胞原位检测方法对组织切片中的凋亡细胞进行观察和比较。结果 正常胃粘膜无Fas基因表达。FasmRNA在肠化生组织中的表达率为 75 .0 0 % ,显著高于萎缩性胃炎( 37.5 0 % ,P <0 .0 1)和胃癌 ( 5 2 .83% ,P <0 .0 5 )。Fas蛋白在肠化生组织中的表达率为 80 .5 6 % ,显著高于萎缩性胃炎 ( 37.5 0 % ,P <0 .0 1)、异型增生 ( 5 5 .0 0 % ,P <0 .0 5 )和胃癌 ( 4 5 .2 8% ,P <0 .0 1)。χ2 检验表明两种方法检测阳性率差异无显著性。凋亡细胞原位检测结果显示 ,Fas蛋白表达阳性萎缩性胃炎、肠化生和胃癌组织中的凋亡细胞指数显著高于Fas蛋白阴性组 (P <0 .0 5及P <0 .0 1) ,Fas蛋白表达状态与细胞凋亡指数呈正相关 (r =0 .393,P <0 .0 1)。结论 Fas基因对胃癌前组织及胃癌细胞凋亡具有促进性调控作用 。

Bcl-2和Fas基因在瘢痕成纤维细胞中的表达

目的 研究凋亡基因 Fas/ Apo- 1和抑凋亡相关基因 Bcl- 2在瘢痕形成机制中的作用。方法 采用免疫组织化学方法对 10例正常皮肤、10例增生性瘢痕及 10例瘢痕疙瘩成纤维细胞 Fas/ Apo- 1和 Bcl- 2蛋白的表达进行检测。 Fas蛋白稀释为 1∶ 5 0 ;Bcl- 2蛋白稀释为 1∶ 40 ,阴性对照以 PBS代替一抗。随机选择五个高倍视野 ,计算其细胞平均阳性率。结果 Bcl- 2蛋白在正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中阳性率分别为 6 .78%、38.6 %和 83.2 %。瘢痕疙瘩、增生性瘢痕的表达阳性率高于正常皮肤 ,有非常显著性差异 (P<0 .0 1) ,而瘢痕疙瘩的表达阳性率明显高于增生性瘢痕 (P <0 .0 1)。 Fas/ Apo- 1蛋白在正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中阳性率分别为78.4%、 80 .4%和 84.4% ,三组间无显著性差异 (P>0 .0 5 )。结论 病理性瘢痕的形成与 Bcl- 2基因的过度表达有关 ,而对 Fas基因介导的凋亡不敏感或凋亡受阻 ,亦是导致瘢痕过度增生原因之一。

人参皂甙Re对急性缺血再灌注心肌细胞凋亡及fas基因表达的影响

目的 研究人参皂甙Re对急性缺血再灌注心肌细胞凋亡及fas基因表达的影响 ,探讨人参皂甙Re抑制缺血再灌注心肌细胞凋亡的分子机制。方法 结扎Wistar大鼠左冠状动脉前降支 (LAD) ,建立大鼠急性缺血再灌注动物模型。 30只大鼠分 3组 (每组 10只 ) :人参皂甙Re组 ,缺血再灌注组和假手术组。用透射电镜和TUNEL法检测心肌细胞凋亡 ,并用光学显微镜进行凋亡细胞计数 ,免疫组化法检测Fas蛋白表达 ,利用图像分析系统检测阳性结果的平均吸光度 (A)值进行定量分析。结果 心肌细胞的凋亡数在缺血再灌注组、假手术组和人参皂甙Re治疗组每视野分别为 134 4 5± 4 5 6 1、 0 18± 0 0 9和 90 6 6± 19 2 2 ,各组间的心肌细胞凋亡数有显著差异 (P <0 0 5 )。缺血再灌注组、假手术组和人参皂甙Re治疗组的Fas蛋白的平均A值分别为 :0 13± 0 0 3、 0 0 6± 0 0 1和 0 0 7± 0 0 1,人参皂甙Re治疗组与缺血再灌注组相比差异有显著性意义 (P <0 0 5 )。结论 人参皂甙Re能显著抗急性缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡 ,抑制急性缺血再灌注诱导心肌细胞内Fas蛋白表达可能是作用机制之一。

Fas基因转导大肠癌细胞株的表达

目的建立表达外源性Fas基因的大肠癌细胞株,观察Fas基因在转导前后的表达。方法采用分子克隆技术将Fas基因插入真核表达载体pBK-CMV的多克隆位点之间,以脂质体介导法将Fas基因导入受体细胞LoVo,用G418筛选克隆细胞。以dot blotting,Western blotting检测转导细胞Fas基因的表达。结果成功建立了Fas基因表达株。转导株在RNA及其蛋白水平表达均明显高于非转导株,转导细胞增殖速度、倍增时间、对数生长期等均比非转导株更为缓慢,但无显著性差异,在Fas抗体作用下,转导株细胞生长明显受到抑制,有非常显著性差异。结论Fas基因在大肠癌细胞中处于低表达状态;通过真核表达载体介导,Fas基因在RNA及其蛋白水平能有效表达。Fas表达株在Fas抗体作用下可明显抑制体外培养的大肠癌细胞的生长增殖。

胃癌组织Fas基因表达与细胞凋亡和增殖的关系

目的: 探讨Fas基因表达水平与胃癌细胞增殖活性及细胞凋亡程度的关系.方法: 胃癌组织53例,用原位杂交及免疫组化染色法分别检测FasmRNA,Fas蛋白和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,并采用凋亡细胞原位检测方法对组织切片中的凋亡细胞进行观察和比较.结果: 胃癌组织表达FasmRNA28例( 52 8% ),表达Fas蛋白24例( 45 3% ),两种方法检测结果一致性非常显著(P<0 01).胃癌53例增殖期细胞标记物PCNA表达及凋亡细胞的阳性率均为100%,细胞凋亡和细胞增殖指数呈显著性负相关(r= -0 982,P<0 01).随胃癌细胞Fas蛋白表达水平升高,PCNA阳性细胞指数相应减少,肿瘤凋亡细胞指数则相应增加.Fas蛋白组细胞凋亡指数显著高于- /+组(P<0 01 ),Fas蛋白组PCNA指数显著高于 / 组(P<0 01 ).结论: 胃癌细胞Fas基因表达可引起细胞凋亡增加与增殖减少.

Fas基因介导的细胞凋亡在帕金森病发病中的作用

目的探讨Fas基因介导的细胞凋亡在帕金森病发病中的作用。方法(1)将45只大鼠随机分为空白对照组、帕金森病组、Fas小干扰RNA(siRNA)组,每组15只。空白对照组大鼠于左侧脑黑质内注入生理盐水3μL,帕金森病组大鼠于左侧脑黑质内注入3μL的5μg/μL 6-羟多巴胺(6-OHDA),Fas siRNA组大鼠于左侧脑黑质内注入Fas siRNA 3μL(1.0 nmol/L),2天后同侧注射同计量的6-OHDA。采用免疫组化检测3组大鼠中脑阳性多巴胺细胞数,并采用PCR法检测3组大鼠中脑组织Fas mRNA表达情况。(2)将153例帕金森病患者根据Hoehn-Yahr分期分为轻度组21例、中度组85例、重度组47例,再选取177例健康者作为对照组,比较4组血清可溶性Fas(sFas)及其配体(sFasL)水平。结果(1)Fas siRNA组大鼠旋转率较帕金森病组减少,空白对照组、Fas siRNA组、帕金森病组酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞计数依次降低,Fas mRNA表达水平依次升高(均P<0.05)。帕金森病组与Fas siRNA组大鼠的Fas-mRNA表达水平与TH阳性细胞呈负相关性(均P<0.05)。(2)中度组和重度组患者血清sFas和sFasL水平均高于对照组和轻度组,且重度组以上指标均高于中度组;帕金森患者sFas和sFasL水平与Hoehn-Yahr分期呈正相关(均P<0.05)。结论Fas表达上调可促进细胞凋亡,从而参与帕金森病的发生和发展。