nanoLC-MS/MS检测未成熟树突状细胞与其外泌体蛋白组分差异的初步研究

目的采用一种相对快速、样品需求量少的纳升级液相色谱串联质谱(nanoLC-MS/MS)法初步探究未成熟树突状细胞DC2.4及其来源的外泌体(DC-Exo)蛋白组分差异。方法收集DC2.4细胞培养基上清,采用梯度离心法分离DC-Exo,使用蔗糖密度梯度超速离心进一步纯化而获得DC-Exo测定样品。采用Bradford法测定其蛋白总量,使用动态光散射法和透射电镜分别对DC-Exo粒度分布和形态进行考察。采用FASP酶解法制备DC2.4细胞和DC-Exo待测蛋白样品。nanoLC-MS/MS检测待测样品:采用μLPickUp上样模式,上样量仅1μg,Transport liquid及Micro A相均为0.05%三氟乙酸-2%乙腈(V/V)aq.;nanoLC使用Acclaim?PepMap RSLC分析柱,流动相为(A)0.1%甲酸水溶液(V/V)和(B)0.08%甲酸-80%乙腈(V/V),采用梯度洗脱,流速为0.3μL/min;MS/MS采用LTQ Obitrap双重质谱,使用APCI nanospray离子源,"一拖十"数据采集模式。得到结果以Uniport Mouse (Fasta文件)为蛋白数据库,采用SQUEST对DC2.4细胞及DC-Exo蛋白质谱信息进行搜索和匹配,并整理分析。结果得到产量较高、粒径为40~200 nm的DC-Exo。用FASP酶解法处理得到的DC2.4细胞和DC-Exo冻干蛋白样品复溶后可直接上样,且上样量仅需1μg。搜库结果显示,DC2.4细胞含蛋白998种,其中高表达227种,特有蛋白535种;DC-Exo仅含蛋白348种,其中特有高表达18种;两者共有蛋白为306种,共有高表达蛋白7种。结论本实验采用的nanoLC-MS/MS法所需进样量少,可相对快速地初步检测DC2.4细胞及其外泌体的蛋白组分差异。