雷公藤红素通过下调FAT10抑制结直肠癌细胞增殖促进凋亡的研究

目的探究人白细胞抗原F位点相邻转录本10(FAT10)在雷公藤红素(Cel)诱导结直肠癌(CRC)细胞凋亡过程中的机制。方法体外培养结CRC细胞系SW480和HCT116,CCK-8法检测Cel(0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μmol/Lol/L)作用24 h后的细胞活力,并计算半数抑制浓度(IC50)。流式细胞仪检测Cel(0、1.25、5μmol/L)作用结CRC细胞的凋亡情况。RT-qPCR和Western blot检测Cel对结CRC细胞中FAT10表达的影响。结果FAT10 mRNA在结CRC细胞系中呈高表达(P<0.01)。Cel显著降低结CRC细胞的增殖(P<0.01),半数抑制浓度分别为SW480:3.03μmol/L;HCT116:1.63μmol/L。Cel处理24 h后流式检测FITC+PI+凋亡细胞占比增加(P<0.01)。细胞经Cel刺激后FAT10 mRNA和蛋白的表达水平均有所下降,并且呈剂量依赖性(P<0.05)。结论Cel能明显降低结CRC细胞增殖,促进细胞凋亡并伴随着FAT10的下调。

RNAi沉默NFκBp65基因对肝癌细胞FAT10表达的影响

目的观察HepG2细胞中NFκB p65基因沉默对FAT10蛋白表达的影响。方法采用电穿孔法将p65 siRNA转染人肝癌细胞系HepG2细胞,采用Western blot检测各组细胞中p65和FAT10蛋白的表达变化,用染色体核型分析p65干扰对FAT10过表达而导致的非整倍体现象的阻断作用。结果 Western blot结果显示,p65 siRNA干扰可以有效抑制HepG2细胞中NFκB p65的表达,并且通过抑制p65可以有效抑制TNF-α诱导的FAT10高表达,进而通过有效抑制TNF-α诱导的FAT10高表达而阻断TNF-α诱导的非整倍体现象。结论 NFκB p65的表达下调可以抑制TNF-α诱导的FAT10高表达及非整倍体现象。

FAT10通过激活RhoA介导肝细胞性肝癌侵袭 转移

目的:探讨FAT10与肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)恶性病理特征间的相关性,及FAT10对细胞骨架蛋白F-actin的影响及可能的机制。方法:通过免疫组织化学技术检测108例肝癌组织标本中FAT10及active-Rho A蛋白表达,分析它们与患者临床病理特征之间的相关性及二者间的相关性;用7721、Hep G2肝癌细胞株瞬时转染质粒过表达FAT10,用Huh7及LM3细胞株转染si RNA干扰FAT10表达,利用Western blot方法检测过表达和干扰FAT10后肝癌细胞中active-、total-Rho A和ROCK蛋白表达的变化;利用免疫荧光检测7721细胞过表达FAT10后细胞骨架蛋白F-action的变化。结果:免疫组织化学结果及临床数据的关联性分析表明:高表达FAT10或active-Rho A均与肝癌转移和复发密切相关(FAT 10:复发P=0.004,转移P=0.031;active-Rho A:复发P=0.026,转移P=0.036),且二者的表达水平之间呈明显正相关(P<0.001);生存分析的结果表明:高表达FAT10或Rho A组患者预后明显差于各自低表达组(FAT10:P=0.026;active-Rho A:P=0.019)。Western blot检测显示过表达FAT10增加active-Rho A和ROCK蛋白表达;反之,干扰FAT10则抑制active-Rho A和ROCK蛋白表达(均P<0.01)。免疫荧光显示肝癌细胞株7721过表达FAT10可促进细胞骨架蛋白F-actin的表达和胞膜聚积及连续性变化。结论:FAT10与肝癌恶性病理特征密切相关;并可能通过激活Rho A促进肝癌细胞骨架改变。

RNAi沉默Stat1基因对胶质瘤细胞FAT10表达的影响

目的观察U251人胶质瘤细胞中Stat1基因沉默对FAT10蛋白表达的影响。方法采用电穿孔法将Stat1siRNA转染人胶质瘤细胞系U251细胞,采用Western印迹检测各组细胞中Stat1和FAT10蛋白的表达变化,用染色体核型分析Stat1干扰对FAT10过表达而导致的非整倍体现象的阻断作用。结果 Western印迹结果显示,Stat1 siRNA干扰可以有效抑制U251细胞中Stat1的表达,并且通过抑制Stat1可以有效抑制TNF-α诱导的FAT10高表达,进而通过有效抑制TNF-α诱导的FAT10高表达而阻断TNF-α诱导的非整倍体现象。结论 Stat1的表达下调可以抑制TNF-α诱导的FAT10高表达及非整倍体现象。

酵母双杂交技术鉴定FAT10新的结合蛋白:eEF1A1

目的:利用酵母双杂交技术筛选类泛素蛋白FAT10(HLA-F adjacent transcript 10)在肝癌细胞Hep3B中相互作用的蛋白,为探讨FAT10蛋白在肝癌发生中的作用机制提供依据。方法:利用Clontech GAL4酵母双杂交系统筛选人肝癌细胞系Hep3B的cDNA文库,以获得与FAT10相互作用的蛋白分子;通过回交实验、免疫共沉淀和激光共聚焦细胞内共定位实验验证两者之间的相互作用;通过RNA干扰降低FAT10表达观察真核翻译延伸因子1α1(eEF1A1)的表达情况。结果:酵母双杂交筛选得到相互作用蛋白eEF1A1,激光共聚焦细胞内共定位确定FAT10和eEF1A1均位于细胞质内,存在共定位;回交实验和免疫共沉淀实验再次确认eEF1A1能够与FAT10相互作用;FAT10表达降低伴随着eEF1A1的表达下调。结论:FAT10能够与eEF1A1相互作用;FAT10可能通过eEF1A1来实现其部分功能。

FAT10过表达对HepG2肝癌细胞生长及凋亡的影响

目的:探讨FAT10过表达对人肝癌细胞株HepG2生长和凋亡的影响。方法:采用脂质体法将FAT10质粒导入HepG2细胞,建立FAT10过表达的肝癌细胞系。Western blot检测细胞中FAT10表达水平,CCK-8细胞计数试剂盒,Annexin V凋亡试剂盒检测FAT10过表达对HepG2细胞生长和凋亡的影响。人类基因表达谱芯片检测FAT10下游与细胞增殖和凋亡相关基因的差异表达。结果:Western blot结果显示FAT10过表达细胞FAT10蛋白水平明显高于对照组,CCK-8检测显示FAT10过表达细胞增殖速度高于空载体组和对照组,而抗喜树碱诱导凋亡的能力FAT10过表达组较空载体组和对照组强。芯片分析显示,FAT10下游与细胞增殖和凋亡相关的若干基因表达有显著差异。结论:FAT10过表达可以促进HepG2细胞增殖和抗凋亡能力。

FAT10基因单体型与肝细胞癌的相关性研究

背景与目的:人类白细胞抗原FAT10是类泛素调节子蛋白家族中的一员,被认为与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生、发展密切相关。本研究探讨FAT10基因单体型与肝细胞癌的关系。方法:收集254例肝癌病例和268例健康对照人群外周血标本,提取DNA,通过DNA测序分析方法,检测两组人群FAT10基因外显子和侧翼序列单核苷酸多态性。应用Haploview统计软件分析研究对象的连锁不平衡和单体型,并应用病例对照分析方法进行相关性研究。结果:在肝癌组和对照组FAT10基因外显子和侧翼序列上共检测到10个多态性位点。遗传不平衡发现-143 A/G、-121 A/G、+3446 C/T、+3476 T/C、+3527 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G、+3803 C/G、+3809 G/T 9个SNPs在同一个单体型块,其中-121 A/G、+3476 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G和+3809 G/T多态位点完全连锁。进一步选择-143 A/G、+3476 T/C和+3527T/C 3个tagSNPs进行关联分析和单体型构建,发现-143 A/G和+3476 T/C基因型与相应的野生型纯合子相比能明显降低肝癌发病的风险(P<0.05)。进一步单体型分析发现ATT、ATC、GCT和ACT 4种单体型,其中肝癌患者的GCT和ACT单体型频率显著低于对照组(P<0.05),而ATT单体型频率显著高于对照组(P<0.05),经过1×108的随机置换检验校正后,ATT和GCT单体型与肝癌的发病风险仍然显著相关。结论:FAT10基因单体型可能与肝癌的发病风险相关,ATT单体型可能是肝癌的遗传标志。

FAT10表达与乳腺浸润性导管癌生物学行为的关系

目的:研究双泛素(diubiquitin,FAT10)表达与乳腺浸润性导管癌生物学行为的关系。方法:免疫组织化学检测50例乳腺浸润性导管癌组织中FAT10,雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)及人表皮生长因子受体(c-erb B2)的表达;Western印迹检测FAT10在乳腺癌细胞系MB-MDA-435和转染FAT10 si RNA表达质粒的MB-MDA-435,MCF-7和转染FAT10表达质粒的MCF-7中的表达;Transwell小室检测4种乳腺癌细胞系的侵袭能力。结果:乳腺浸润性导管癌中,FAT10的阳性表达强度与病理学分级、淋巴结转移、远处转移及TNM分期有关(P<0.01),而与患者年龄及肿瘤大小无关(P>0.05);受体阴性组中FAT10的阳性表达强度显著高于受体阳性组(P<0.01),三阴乳腺癌中FAT10的阳性表达强度率显著高于受体阳性组和受体阴性组(P<0.01);FAT10表达阳性组生存率明显低于FAT10表达阴性组(P<0.05);Western印迹结果显示高侵袭性乳腺癌细胞系中FAT10阳性表达强度显著高于低侵袭乳腺癌细胞系;上调FAT10表达能增强乳腺癌细胞系的侵袭能力,而下调其表达能降低乳腺癌细胞系的侵袭能力(P<0.01)。结论:FAT10可能具有直接或间接增加乳腺癌细胞的侵袭能力的作用,在乳腺癌患者的侵袭和转移中起重要的作用,它有可能作为判断乳腺癌预后的又一独立指标及靶向治疗乳腺癌特别是三阴乳腺癌的潜在靶点。

类泛素蛋白FAT10共价结合底物蛋白质的活性分析

目的探讨类泛素蛋白FAT10的C末端双甘氨酸基团及双泛素结构域结合修饰底物蛋白质的活性。方法分别将野生型全长FAT10,C末端双甘氨酸的缺失突变体FAT10ΔGG,分别包含N端、C端泛素结构域的截断突变体FAT10-N和FAT10-C构建到真核表达载体中,转染HEK293T细胞,并使用26S蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞。利用Western blot方法检测野生型FAT10及其突变体结合底物蛋白质的活性。结果与野生型FAT10的蛋白质底物结合能力相比,FAT10ΔGG、FAT10-N、FAT10-C与底物蛋白质结合能力均显著下降。蛋白酶体抑制剂MG132能够促进FAT10及其突变体的底物结合活性。结论 FAT10的C末端双甘氨酸基团及双泛素结构域都是FAT10与底物共价结合所需的活性基团,被FAT10标记后的底物蛋白质通过26S蛋白酶体途径降解。

FAT10基因在肝细胞癌中的表达和突变分析

目的:探讨FAT10基因在肝细胞癌中的表达和突变情况。方法:应用Western blot检测60例肝癌患者癌和癌旁组织FAT10蛋白表达水平。采用DNA直接测序方法检测60例肝癌患者(癌和癌旁组织)和5种人肝癌细胞中FAT10基因编码区遗传变异情况。结果:在60例肝癌中,85%(51/60)的肝癌组织FAT10蛋白的表达明显高于癌旁组织。在60例肝癌患者和5种人肝癌细胞中检测到FAT10基因编码区存在7个单核苷酸多态性位点,未发现基因突变。结论:FAT10在肝癌中的异常表达并不依赖于该基因突变,可能存在其他机制。

FAT10基因表达与结直肠癌患者临床病理因素及预后的关系

目的:探讨结直肠癌(CCT)组织中FAT10(Diubiquitin,双泛素)的基因表达与其病理因素及预后的关系。方法:收集我院2000～2003年73例有5年以上完整随访资料的结直肠癌术后患者,采用RT-PCR方法检测FAT10 mRNA在CCT、癌旁组织(TCT)和正常结直肠组织(NCT)中的表达情况,并分析临床病理因素对FAT10阳性表达率和相对表达量的影响,以及FAT10表达与预后的关系。结果:FAT10 mRNA在CCT阳性表达率为52.24%(35/67),且在CCT的相对表达量(0.735±0.034)明显高于TCT(0.561±0.044)和NCT(0.397±0.028)(P<0.05);FAT10 mRNA的阳性表达率及相对表达量受临床进展、淋巴结转移和TNM分级的影响较明显(P<0.05),而患者年龄、肿瘤大小、肿瘤分化程度等对其无明显影响(P>0.05);Log-Rank检验显示CCT患者中,FAT10表达阳性者生存率明显低于FAT10表达阴性者(P<0.01)。结论:FAT10在CCT的表达状况与CCT转移及预后关系密切,可以作为反映生物学行为和判断预后的有效指标。

类泛素蛋白FAT10在食管癌中的表达及生物学作用

目的:探讨类泛素蛋白FAT10的异常表达在食管癌(esophageal carcinoma,ECA)进展中的作用机制。方法:采用RT-PCR和Western blot法检测FAT10在30例ECA标本中的mRNA和蛋白表达水平。siRNA技术干扰食管癌细胞ECA-109中FAT10表达后,MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测ECA-109细胞周期和细胞凋亡的变化,Western blot检测Akt/GSK3β信号通路的变化。结果:RT-PCR和Western blot结果显示,FAT10在食管癌组织中的表达水平较癌旁组织显著上调(P<0.05)。siRNA技术干扰ECA-109细胞中FAT10表达后,ECA-109细胞生长速度明显下降(P<0.05)。流式细胞术结果显示FAT10 siRNA干扰ECA-109细胞48h时,对细胞周期分布无明显影响(P>0.05)。但FAT10表达下调有促凋亡作用,与对照组相比,干扰组的细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测到ECA-109细胞中Akt和GSK3β的磷酸化水平都明显下降。结论:FAT10基因在食管癌组织中表达上调,下调FAT10的表达能够抑制食管癌进展,机制可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。

TNF-α和IFN-γ诱导人乳头状甲状腺癌细胞FAT10过表达及染色体核型异常

目的:观察TNF-α和IFN-γ通过诱导人乳头状甲状腺癌TPC-1细胞中FAT10的表达而导致染色体核型异常。方法:采用电穿孔法将FAT10 siRNA转染人TPC-1细胞,采用Western blot检测各组细胞中FAT10蛋白的表达变化,用染色体核型分析TNF-α和IFN-γ诱导TPC-1细胞非整倍体现象。结果:Western blot结果显示,TPC-1细胞经TNF-α和IFN-γ诱导后,FAT10过表达。FAT10 siRNA干扰可以有效抑制TPC-1细胞中FAT10的表达,并且通过抑制FAT10表达,可以有效抑制TNF-α和IFN-γ诱导的非整倍体。进而发现FAT10表达具有拮抗TNF-α和IFN-γ诱导的TPC-1细胞凋亡的作用。结论:FAT10介导了TNF-α和IFN-γ诱导的TPC-1细胞的非整倍体现象,并具有拮抗凋亡的作用。

FAT10在4-硝基喹啉-1-氧化物诱导舌癌模型中的表达特点

目的:建立与人舌黏膜鳞癌相近的大鼠舌癌模型,并研究其发生发展过程中双泛素FAT10的表达变化。方法:实验组SD雄性大鼠使用含有40μg/m L的4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)饮水喂养,分别在8、16、24周时取大鼠舌体中病灶部位组织,行组织学观察;对照组大鼠正常饮用水喂养24周。使用免疫组织化学法检测FAT10、p53在舌黏膜不同程度病变组织中的表达。结果:大鼠舌黏膜经过4-NQO不同时间的刺激,可发展成不同程度的上皮异常增生以及鳞状细胞癌。从正常黏膜到不同程度的不典型增生以及最后高分化的鳞癌中,FAT10的表达强度呈逐渐增高趋势;p53在正常黏膜为阳性表达,在不典型增生中表达升高,而在癌组织中表达降低。结论:在舌癌的发生、发展过程中,FAT10可能发挥了癌基因的作用。

类泛素蛋白FAT10介导的蛋白酶体降解途径

泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是细胞内蛋白质降解的一个重要途径,在此过程中,泛素需要通过酶级联途径与靶蛋白形成多聚泛素化链,才能被26S蛋白酶体识别并降解,而泛素单体并不能有效启动蛋白酶体降解信号.FAT10(human leukocyte antigen Fassociated transcript 10)是唯一能直接介导蛋白酶体降解途径的类泛素蛋白(ubiquitin-like modifiers,UBLs),不仅与泛素结构相似,而且在功能上也类似,但其调节靶蛋白降解途径不依赖于泛素.与泛素相比,FAT10单体能有效结合26S蛋白酶体,并高效调节蛋白酶体降解.因此,FAT10-蛋白酶体降解途径(FAT10-proteasome system,FPS)是1条独立于泛素之外的蛋白质降解途径.近年研究发现,FPS在调控细胞生物学功能方面发挥重要作用,并受到广泛关注,本文就FAT10-蛋白酶体降解途径的研究做一综述.

舌癌组织FAT10 mRNA表达与临床病理特征关系的研究

目的:探讨舌癌组织中FAT10 mRNA的表达与舌癌患者病理因素及预后的相关性。方法:收集我院2001—2004年120例有5年以上完整随访资料的舌癌术后患者,采用RT-PCR方法检测舌癌组织(TCT)和正常舌组织(NTT)中FAT10 mRNA的表达情况,分析FAT10基因表达与舌癌患者临床病理资料之间的关系。结果:FAT10 mRNA在本组舌癌中阳性表达率为55.56%(65/117),与正常舌组织相比,FAT10基因在舌癌组织中的表达量(0.85±0.05)明显增加(P<0.05),且FAT10 mRNA的表达与淋巴结转移、肿瘤分化程度和TNM分级等密切相关(P<0.05),而与患者的年龄、性别、肿瘤大小等无关(P>0.05)。Log-rank分析发现FAT10 mRNA阳性表达者生存率明显低于阴性者(P<0.05)。结论:FAT10 mRNA的表达与舌癌的转移及预后等关系密切,有可能作为反映舌癌生物学行为和判断预后的有效指标。

RNA干扰FAT10基因对舌癌细胞系Tca8113增殖和侵袭的影响

目的:应用RNA干扰技术抑制人舌癌细胞株Tca8113中FAT10基因的表达,探讨FAT10基因表达下调对舌癌细胞生物学行为的影响。方法:构建针对FAT10基因特异性siRNA真核表达载体pU-FAT10-siRNA,将其转染至舌癌细胞株Tca8113,采用RT-PCR、Western印迹等方法检测转染后的Tca8113细胞中FAT10的表达。通过流式细胞仪分析siRNA对舌癌细胞周期的影响,并通过细胞侵袭能力实验观察siRNA对Tca8113细胞恶性生物学行为的影响。结果:siRNA干扰Tca8113细胞后,FAT10的表达无论是在mRNA水平还是在蛋白质水平均显著下降(P<0.05),细胞周期被阻滞在G1期,细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降。结论:通过RNAi技术阻断FAT10的表达,可抑制Tca8113细胞的生长、增殖、迁徙,提示FAT10基因在舌癌的发生发展过程中起重要作用。

乳腺癌患者预后及病理因素与FAT10 mRNA表达的相关性

目的探讨乳腺癌组织中FAT10 mRNA的表达与乳腺癌患者病理因素及预后的相关性。方法收集67例乳腺癌术后患者资料,采用RT-PCR方法检测乳腺癌组织、癌旁组织和正常乳腺组织中FAT10 mRNA的表达情况,并分析该基因表达对乳腺癌患者临床病理因素及预后的影响。结果 FAT10 mRNA在本组乳腺癌中阳性表达率为52.24%(35/67),在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织和正常乳腺组织(P<0.05),FAT10mRNA的表达与淋巴结转移和TNM分级密切相关(P<0.05),而与患者的年龄、肿瘤大小、肿瘤分化程度等无关(P>0.05)。FAT10阳性表达者生存率明显低于阴性者(P<0.05)。结论 FAT10在乳腺癌组织表达状态与乳腺癌的转移及预后关系密切,可以作为反映乳腺癌生物学行为和判断预后的有效指标。

FAT10基因在原发性骨肉瘤组织中的表达及意义

目的探讨双泛素(FAT10)在原发性骨肉瘤发生发展中的可能作用机制,为以FAT10指标对原发性骨肉瘤的诊断和以FAT10为靶点进行原发性骨肉瘤生物学治疗提供理论依据。方法收集22例原发性骨肉瘤及其骨肉瘤旁骨组织和12例同期接受手术的良性病变骨组织的新鲜标本,采用RT-PCR检测组织中FAT10 mRNA的表达。结果 FAT10 mRNA在原发性骨肉瘤组织、原发性骨肉瘤旁组织和良性病变骨组织中的阳性表达率分别为81.82%(18/22)、13.64%(3/22)和8.33%(1/12)。原发性骨肉瘤旁组织FAT10 mRNA阳性表达率与良性骨组织组织相比,差异无统计学意义(>0.05);原发性骨肉瘤中FAT10 mRNA阳性表达率明显高于原发性骨肉瘤旁组织和良性病变骨组织,差异均有统计学意义(均<0.05)。结论 FAT10mRNA在原发性骨肉瘤中的表达明显上调,其可能成为一个诊断原发性骨肉瘤的检测指标,并为开发骨肉瘤化疗提供新的靶点。

FAT10单核苷酸多态性与肝细胞癌发生发展的关联

目的探讨FAT10基因外显子和侧翼序列单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism,SNP)与肝细胞癌发生和临床病理的关系。方法通过DNA测序分析方法,检测254例肝癌和268例健康对照人群的FAT10基因SNPs,并比较不同基因型与肝细胞癌的发生和临床病理的的关系。采用Haploview统计软件分析研究对象的连锁不平衡和单体型。结果在肝癌组和对照组共检测到10个SNPs位点。其中-143A/G,-121A/G,+3476T/C,+3607T/C,+3620C/G和+3809G/T基因型与相应的野生型纯合子相比能明显降低肝癌发病的风险(P<0.05),但是这些多态性位点的基因型频率与肝癌的临床表型无关(P>0.05)。进一步单体型分析发现,各变异等位基因在病例组和对照组内均存在遗传连锁不平衡现象,AATTTCG、AATCTCG、GGCTCGT和AGCTCGT为四种常见的单体型。GGCTCGT和AGCTCGT单体型可能对肝癌的发病起保护性效应(OR=0.41,95%CI:0.24～0.70,P<0.05和OR=0.43,95%CI:0.22～0.983,P<0.05),而AATTTCG单体型可能增加肝癌的发病风险(OR=1.64,95%CI:1.24～2.17,P<0.05)。结论本研究首次发现中国汉族人群FAT10基因外显子和侧翼序列SNPs与肝癌的易感性相关,但需要不同种族的大样本和功能研究进一步验证。