酵母双杂交技术鉴定FAT10新的结合蛋白:eEF1A1

目的:利用酵母双杂交技术筛选类泛素蛋白FAT10(HLA-F adjacent transcript 10)在肝癌细胞Hep3B中相互作用的蛋白,为探讨FAT10蛋白在肝癌发生中的作用机制提供依据。方法:利用Clontech GAL4酵母双杂交系统筛选人肝癌细胞系Hep3B的cDNA文库,以获得与FAT10相互作用的蛋白分子;通过回交实验、免疫共沉淀和激光共聚焦细胞内共定位实验验证两者之间的相互作用;通过RNA干扰降低FAT10表达观察真核翻译延伸因子1α1(eEF1A1)的表达情况。结果:酵母双杂交筛选得到相互作用蛋白eEF1A1,激光共聚焦细胞内共定位确定FAT10和eEF1A1均位于细胞质内,存在共定位;回交实验和免疫共沉淀实验再次确认eEF1A1能够与FAT10相互作用;FAT10表达降低伴随着eEF1A1的表达下调。结论:FAT10能够与eEF1A1相互作用;FAT10可能通过eEF1A1来实现其部分功能。

类泛素蛋白FAT10在食管癌中的表达及生物学作用

目的:探讨类泛素蛋白FAT10的异常表达在食管癌(esophageal carcinoma,ECA)进展中的作用机制。方法:采用RT-PCR和Western blot法检测FAT10在30例ECA标本中的mRNA和蛋白表达水平。siRNA技术干扰食管癌细胞ECA-109中FAT10表达后,MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测ECA-109细胞周期和细胞凋亡的变化,Western blot检测Akt/GSK3β信号通路的变化。结果:RT-PCR和Western blot结果显示,FAT10在食管癌组织中的表达水平较癌旁组织显著上调(P<0.05)。siRNA技术干扰ECA-109细胞中FAT10表达后,ECA-109细胞生长速度明显下降(P<0.05)。流式细胞术结果显示FAT10 siRNA干扰ECA-109细胞48h时,对细胞周期分布无明显影响(P>0.05)。但FAT10表达下调有促凋亡作用,与对照组相比,干扰组的细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测到ECA-109细胞中Akt和GSK3β的磷酸化水平都明显下降。结论:FAT10基因在食管癌组织中表达上调,下调FAT10的表达能够抑制食管癌进展,机制可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。

类泛素蛋白FAT10共价结合底物蛋白质的活性分析

目的探讨类泛素蛋白FAT10的C末端双甘氨酸基团及双泛素结构域结合修饰底物蛋白质的活性。方法分别将野生型全长FAT10,C末端双甘氨酸的缺失突变体FAT10ΔGG,分别包含N端、C端泛素结构域的截断突变体FAT10-N和FAT10-C构建到真核表达载体中,转染HEK293T细胞,并使用26S蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞。利用Western blot方法检测野生型FAT10及其突变体结合底物蛋白质的活性。结果与野生型FAT10的蛋白质底物结合能力相比,FAT10ΔGG、FAT10-N、FAT10-C与底物蛋白质结合能力均显著下降。蛋白酶体抑制剂MG132能够促进FAT10及其突变体的底物结合活性。结论 FAT10的C末端双甘氨酸基团及双泛素结构域都是FAT10与底物共价结合所需的活性基团,被FAT10标记后的底物蛋白质通过26S蛋白酶体途径降解。

双泛素与肿瘤关系的研究进展

双泛素属于泛素相关蛋白,由两个泛素样部分前后融合而成,是p53基因的一个下游靶点,与人纺锤体聚集检测点蛋白(MAD2)非共价结合导致染色体不稳定,与许多肿瘤的发生密切相关。以下仅就双泛素的结构、分子生物学功能及其与p53基因、MAD2蛋白和肿瘤发生的关系作一综述,为肿瘤的发生及治疗开辟新的思路。

结肠癌患者中P53与FAT10的表达及临床意义

目的探讨结肠癌患者P53和FAT10蛋白的表达及临床意义。方法选取2018年1月至2019年12月在济南市章丘区人民医院行结肠癌根治术的75例患者为研究对象,检测切除标本中肿瘤组织、癌旁组织和正常结肠黏膜组织中FAT10和P53蛋白表达水平,分析两种蛋白在结肠癌发病中的意义。结果标本中正常结肠黏膜组织FAT蛋白及P53蛋白阳性率均低于癌旁组织和癌组织,差异有统计学意义(1.33%比10.67%比64.00%,1.33%比12.00%比65.33%,F值分别为90.65、91.16,P值均<0.05)。正常结肠黏膜组织中FAT10和P53蛋白染色评分均低于癌旁组织和结肠癌组织,差异有统计学意义[(0.17±0.02)比(0.67±0.11)比(4.33±0.99),(0.16±0.03)比(0.69±0.13)比(4.28±0.97),F值分别为1169.32、1179.07,P值均<0.05]。FAT10蛋白和P53蛋白阳性表达在癌症病灶分化程度、TNM分期、浸润深度和淋巴结转移等方面差异有统计学意义(P<0.05)。FAT蛋白阴性的2年存活率高于阳性患者(92.59%比70.88%,χ^(2)=4.88,P<0.05);P53蛋白阴性的2年存活率高于阳性患者(92.31%比71.43%,χ^(2)=4.41,P<0.05)。结论结肠癌组织中P53蛋白和FAT10蛋白高表达,对两种蛋白的检测可以预判结肠癌患者的恶性程度及预后情况。

类泛素蛋白FAT10:一个具有抵抗心肌细胞凋亡作用的新分子

目的:确定FAT10在心肌细胞的表达及其在细胞凋亡中发挥的作用。方法:①提取大鼠、小鼠和人心脏组织总RNA与总蛋白,分别用RT-PCR与Western Blot检测FAT10的表达。②构建大鼠心肌梗死(心梗)模型与大鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型,分别用实时荧光定量PCR与Western Blot检测FAT10的表达变化。③体外构建FAT10过表达慢病毒,转染原代心肌细胞后暴露于H/R的环境中,通过流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,用Western Blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2与BAX的表达量。结果:FAT10的mRNA与蛋白在大鼠、小鼠和人的正常心脏组织中均有表达。在大鼠心梗模型的梗死心肌边缘区与H/R处理的大鼠原代心肌细胞中,FAT10表达量明显升高。在原代心肌细胞中过表达FAT10可以降低H/R引起的细胞凋亡,并且升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,下调促凋亡蛋白BAX的表达。结论:FAT10是心肌组织表达的新蛋白,具有心脏保护作用,FAT10的表达上调能对抗心肌细胞凋亡。

胃癌组织FAT10与突变型p53表达及其相互关系

目的检测FAT10与突变型p53在胃癌组织中的表达情况及相互间关系。方法采用免疫组化和逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测FAT10和突变型p53在62例胃癌患者的胃癌组织、癌旁组织（距癌边缘2～5cm）及正常胃组织（距癌边缘〉5cm）中的表达水平，统计分析两者表达间的关联性及FAT10与胃癌预后之间的关系。结果FATl0蛋白和突变型p53蛋白在胃癌组织中的表达阳性率分别为51．61％（32／62）和45．16％（28／62），显著高于癌旁组织[12．90％（8／62）和14．51％（9／62），χ^2值分别=21．26和20．69，P值均〈0．01]及正常胃组织[6．45％（4／62）和9．68％（6／62），χ^2值分别=13．91和19．61，P值均〈0．01]。胃癌FAT10蛋白及mRNA的表达上升主要与胃癌的淋巴转移及TNM分期密切相关（P值均〈0．05）。胃癌组织中FAT10表达在蛋白及基因水平均与突变型p53表达呈正相关性（r值分别=0．865和0．761，P值分别〈0．05和0．01）。FAT10蛋白阳性表达或mRNA表达水平高者，其累计生存时间显著低于FAT10阴性者（P值均〈0．05）。结论FAT10与突变型p53在胃癌组织中表达上调且呈正相关性，两者可能共同参与胃癌的形成与发展，FAT10对评价胃癌的预后可能有较好的价值。