酵母双杂交技术鉴定FAT10新的结合蛋白:eEF1A1

目的:利用酵母双杂交技术筛选类泛素蛋白FAT10(HLA-F adjacent transcript 10)在肝癌细胞Hep3B中相互作用的蛋白,为探讨FAT10蛋白在肝癌发生中的作用机制提供依据。方法:利用Clontech GAL4酵母双杂交系统筛选人肝癌细胞系Hep3B的cDNA文库,以获得与FAT10相互作用的蛋白分子;通过回交实验、免疫共沉淀和激光共聚焦细胞内共定位实验验证两者之间的相互作用;通过RNA干扰降低FAT10表达观察真核翻译延伸因子1α1(eEF1A1)的表达情况。结果:酵母双杂交筛选得到相互作用蛋白eEF1A1,激光共聚焦细胞内共定位确定FAT10和eEF1A1均位于细胞质内,存在共定位;回交实验和免疫共沉淀实验再次确认eEF1A1能够与FAT10相互作用;FAT10表达降低伴随着eEF1A1的表达下调。结论:FAT10能够与eEF1A1相互作用;FAT10可能通过eEF1A1来实现其部分功能。

类泛素蛋白FAT10在食管癌中的表达及生物学作用

目的:探讨类泛素蛋白FAT10的异常表达在食管癌(esophageal carcinoma,ECA)进展中的作用机制。方法:采用RT-PCR和Western blot法检测FAT10在30例ECA标本中的mRNA和蛋白表达水平。siRNA技术干扰食管癌细胞ECA-109中FAT10表达后,MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测ECA-109细胞周期和细胞凋亡的变化,Western blot检测Akt/GSK3β信号通路的变化。结果:RT-PCR和Western blot结果显示,FAT10在食管癌组织中的表达水平较癌旁组织显著上调(P<0.05)。siRNA技术干扰ECA-109细胞中FAT10表达后,ECA-109细胞生长速度明显下降(P<0.05)。流式细胞术结果显示FAT10 siRNA干扰ECA-109细胞48h时,对细胞周期分布无明显影响(P>0.05)。但FAT10表达下调有促凋亡作用,与对照组相比,干扰组的细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测到ECA-109细胞中Akt和GSK3β的磷酸化水平都明显下降。结论:FAT10基因在食管癌组织中表达上调,下调FAT10的表达能够抑制食管癌进展,机制可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。

双泛素蛋白诱导自噬对肝癌细胞放射敏感度的影响

目的探讨双泛素蛋白(FAT10)对肝癌细胞自噬水平的调节作用,并进一步明确FAT10诱导自噬对肝癌细胞放射敏感度的影响。方法本实验首先通过Western blot及免疫组织化学方法分别从肝癌细胞及临床标本中验证FAT10对自噬相关蛋白的调控作用,进而通过克隆存活实验以明确FAT10诱导自噬对肝癌细胞放射敏感度的调节作用。结果 FAT10过表达可促进自噬相关蛋白Beclin1和LC3-Ⅰ/Ⅱ表达并抑制p62的表达,且经X射线照射后上述表达改变更明显。免疫组织化学分析结果显示FAT10与Beclin1具有显著相关性(P<0.01),高表达FAT10的肝癌标本同时伴有Beclin1表达升高。克隆存活实验表明FAT10过表达增加肝癌细胞的放射抵抗性,敲除FAT10则增加肝癌细胞的放射敏感度。当使用自噬抑制剂3-MA或特异性干扰Beclin1以抑制肝癌细胞发生自噬后则上述FAT10表达改变不能引起肝癌细胞的放射敏感度的改变。结论 FAT10表达增加可通过诱导自噬形成进而增强肝癌细胞的放射抵抗性。

胃癌组织FAT10与突变型p53表达及其相互关系

目的检测FAT10与突变型p53在胃癌组织中的表达情况及相互间关系。方法采用免疫组化和逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测FAT10和突变型p53在62例胃癌患者的胃癌组织、癌旁组织（距癌边缘2～5cm）及正常胃组织（距癌边缘〉5cm）中的表达水平，统计分析两者表达间的关联性及FAT10与胃癌预后之间的关系。结果FATl0蛋白和突变型p53蛋白在胃癌组织中的表达阳性率分别为51．61％（32／62）和45．16％（28／62），显著高于癌旁组织[12．90％（8／62）和14．51％（9／62），χ^2值分别=21．26和20．69，P值均〈0．01]及正常胃组织[6．45％（4／62）和9．68％（6／62），χ^2值分别=13．91和19．61，P值均〈0．01]。胃癌FAT10蛋白及mRNA的表达上升主要与胃癌的淋巴转移及TNM分期密切相关（P值均〈0．05）。胃癌组织中FAT10表达在蛋白及基因水平均与突变型p53表达呈正相关性（r值分别=0．865和0．761，P值分别〈0．05和0．01）。FAT10蛋白阳性表达或mRNA表达水平高者，其累计生存时间显著低于FAT10阴性者（P值均〈0．05）。结论FAT10与突变型p53在胃癌组织中表达上调且呈正相关性，两者可能共同参与胃癌的形成与发展，FAT10对评价胃癌的预后可能有较好的价值。