亮斑扁角水虻幼虫生物转化对鸡粪中FAdV-4的消减作用研究

将亮斑扁角水虻幼虫(black soldier fly larvae,BSFL)接入含禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的鸡粪中(0~18 d),采用TaqMan qPCR和16S rDNA高通量测序分析了BSFL转化过程中FAdV-4含量的动态变化和微生物区系演化。结果表明,BSFL转化能够显著消减鸡粪中的FAdV-4群体载量,转化18 d时FAdV-4减少率达到了99.63%,明显高于对照组(64.74%),并且增加BSFL接种量和日龄能增强对FAdV-4的消减作用;BSFL转化使得物料中的细菌多样性显著降低;厚壁菌门、假单胞菌属受到抑制,而拟杆菌门、异常球菌-栖热菌门丰度则明显提高;居绿藻菌属、特吕珀菌属在BSFL转化体系中与FAdV-4消减密切相关。

Ⅰ群4型禽腺病毒Y17215-1株体外增殖规律及免疫原性研究

为探讨禽腺病毒4型分离株Y17215-1的体外增殖特性和免疫原性,本研究以LMH细胞为模型,摸索Y17215-1株最佳接种剂量和收获时间;通过活毒滴鼻接种和灭活疫苗肌肉注射的方式免疫SPF鸡,测定其免疫原性。结果显示:Y17215-1株0.1 MOI接种LMH细胞,培养48~72 h病毒滴度达到峰值108.625 TCID_(50)/mL。该病毒经肌肉注射对42日龄SPF鸡具有较强致病性,LD_(50)为103.000 TCID_(50)/0.2 mL。以10^(7.676) TCID_(50)的Y17215-1株滴鼻免疫21日龄SPF鸡,免疫后7 d 100%试验鸡产生中和抗体,14 d达到高峰。以Y17215-1株制备灭活疫苗肌肉注射免疫21日龄SPF鸡(10^(7.676) TCID_(50)/羽),免疫后7 d 70%试验鸡产生中和抗体,21 d达到高峰。在免疫后21 d用1000LD_(50)的Y17215-1株进行攻毒,活毒和灭活疫苗的保护率均为100%。以上结果表明:Y17215-1株具有很好的体外增殖特性和免疫原性,可以作为候选疫苗毒株。

血清4型禽腺病毒的分离鉴定及致病性分析

旨在从送检的病鸡中分离鉴定出禽腺病毒(fowl adenovirus,FAdV),为临床诊断和疫病防控提供参考依据。本研究将阳性样品接种SPF鸡胚并传代,利用PCR检测、基因序列分析、动物回归试验等方法鉴定病毒。结果:经过鸡胚传代及病毒特异性检测获得了纯净的FAdV,命名为HB2306;分析Hexon基因序列可知,HB2306株属于血清4型分支,与国内外分离的FAdV-4毒株核苷酸序列同源性为98.2%~99.9%,HB2306株与国内外的4型高致病性毒株氨基酸序列相似性在97.9%~99.8%;受试动物临床病理变化显示,HB2306株以104.5EID50/只的剂量经胸部肌肉注射后,引起宿主心包积液,肝脏变黄肿胀、淤血出血,肾出血、肿胀等典型的病理变化,与流行的高致病性毒株所致临床症状相似,且死亡率为100%。综上,本研究成功分离并鉴定出一株FAdV-4高致病力毒株,丰富了毒种库,为该病毒感染的流行情况调查和综合防控奠定了基础。

一株鹅源禽腺病毒4型的分离及致病性

2023年,昆明一朗德鹅场部分雏鹅出现软脖子症状,伴有零星死亡,病变疑似禽心包积液综合征(hydropericardium syndrome,HPS)。本研究旨在对本次雏鹅病因进行分子病毒学诊断和病原的致病性研究。采集肝病料接种鸡肝癌细胞(leghorn male hepatocellular cells,LMH):1)观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),取培养液负染、电镜观察病毒粒子形态;2)靶标4型禽腺病毒(serotype 4 fowl adenovirus,FAdV-4)的衣壳蛋白编码基因hexon基因进行PCR诊断,对扩增基因序列进行遗传演化分析;3)以5×10^(5.5)TCID_(50)/羽的剂量皮下注射感染10日龄健康泰州鹅,进行动物回归感染以确证其致病性。结果显示,将病料上清接种LMH细胞48~72 h后CPE明显,细胞圆缩、间隙变大、随后碎裂、逐渐脱落,电镜观察见二十面体无囊膜病毒粒子;PCR检测FAdV-4阳性,分离纯化病毒,命名为YNKM2023株;hexon基因的遗传演化分析显示,分离株与国内已有的鸡、鸭FAdV-4流行毒株相似性高达99.8%~99.9%,与印度分离株相似性为99.5%~99.6%。接种感染后,泰州鹅未出现典型的临床症状,但感染后3 d开始出现HPS的特征性病变,感染后6 d检测到中和抗体。综上,本研究成功分离到鹅源FAdV-4/YNKM2023株,该毒株与国内已有的鸡鸭流行毒株高度同源,尚未发生明显的基因漂移。分离株可以感染鹅,病毒可以在雏鹅体内复制引起组织器官病变并产生免疫应答,对鹅表现出一定的致病性,这有助于了解FAdV-4在鹅群的流行情况及其对雏鹅的致病性。

DF-1细胞中TLR7编码基因的敲除及其抗FAdV-4感染的天然免疫应答

旨在构建高质量的禽源细胞系,应用CRISPR/Cas9技术实现鸡胚成纤维细胞(DF-1)的Toll样受体7(TLR7)编码基因的敲除,构建稳定的细胞培养禽腺病毒4型(FAdV-4)增殖体系。采用荧光定量PCR的方法对FAdV-4感染DF-1细胞后先天性免疫信号通路中效应分子进行检测,选择转录水平显著上调的基因TLR7作为研究对象;构建sgRNA载体与Cas9表达载体共转染DF-1细胞,经绿色荧光蛋白(GFP)阳性特征分选单克隆,PCR验证及增毒试验筛选后获得TLR7编码序列敲除的DF-1-TLR7-KO#3单克隆细胞系,命名为DF-1-TLR7-KO细胞。对敲除前后DF-1细胞的天然免疫系统对FAdV-4感染的拮抗效应和病毒在不同细胞中增殖效率的差异进行了研究。结果表明:成功构建的TLR7编码序列敲除的DF-1细胞系,与原始细胞相比病毒增殖能力提高。试验对细胞的天然免疫系统与FAdV-4感染的互作机理进行了初步探索,为更好地研究宿主对病毒入侵的应答机制,提高疫苗生产效能提供了研究基础和生物材料储备。

高致病性FAdV-4传代中的毒力和Fiber2基因的比对分析

为筛选禽腺病毒疫苗株和制备亚单位疫苗提供科学依据,探明高致病性禽腺病毒C亚型4血清型(FAdV-4)毒株在传代中的毒力变化以及不同感染方式对雏鸡死亡率的影响,首先制备2~15代的高致病性FAdV-4尿囊液,用LMH细胞检测第2、4、8和15代尿囊液的半数细胞感染量(TCID_(50));其次选取的4个代次尿囊液分别通过黏膜(点眼)和颈背部皮下途径接种SPF雏鸡,观察动物的死亡率;最后应用PCR方法扩增主要结构蛋白Fiber2基因序列并进行比对分析。结果表明:所有制备的2~15代FAdV-4毒株均在5~7 d内致鸡胚死亡(100%),4个代次毒株的TCID_(50)为10^(6.5±0.2)/0.1 mL,不同代次毒株间的毒力差异不显著(P>0.05);选取的4个代次毒株经颈背部皮下接种雏鸡的死亡率为100%,死亡雏鸡出现典型的心包积液综合征。而经黏膜接种的雏鸡死亡率呈下降趋势,分别为80%、50%、30%和30%;不同代次毒株Fiber2基因序列没有发生变化。总之,不同代次毒株通过皮下接种后对雏鸡的致病力没有差异,但黏膜接种的死亡率则逐代下降,而主要结构蛋白Fiber2基因则没有出现碱基变异。

血清4型禽腺病毒Fiber蛋白的原核表达及其在抗体检测中的应用

为建立特异的血清4型禽腺病毒(FAdV-4)血清学抗体检测技术,试验将FAdV-4纤突蛋白基因fiber-2克隆至载体pET-28a中,构建原核表达载体pET-28a-Fiber-2,获得纯化的重组蛋白His-Fiber-2,以纯化的His-Fiber-2作为包被抗原建立检测Fiber-2抗体的间接ELISA方法,对该方法进行特异性、重复性、稳定性、灵敏性试验,并与BioChek FAdV商品化ELISA试剂盒检测结果进行比较。结果显示:建立的ELISA仅与抗FAdV-4阳性鸡血清发生反应,与检测的抗其他病原的血清以及SPF鸡血清均无反应性,批间重复性与批内重复性良好,其变异系数分别在4.345%~6.983%和4.326%~9.391%之间,包被酶标板保存12个月后,变异系数为4.4%~10.0%,其检测灵敏度是间接免疫荧光检测技术的8~32倍,是基于包被GST-Fiber-2蛋白ELISA的2倍;建立的ELISA对FAdV-4灭活疫苗免疫的鸡血清检出率高于BioChek试剂盒,两者对临床感染FAdV-4的鸡血清的检测结果一致。研究表明,试验构建的基于重组蛋白His-Fiber-2的检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法为临床上FAdV-4感染监测以及疫苗的免疫评价提供了技术,具有良好的应用前景。

Ⅰ群4型禽腺病毒SDTC20株的分离鉴定与致病性研究

从山东郯城某疑似感染禽腺病毒(FAdV)的发病鸡群中采集病料并分离到1株FAdV,克隆纯化后进行PCR检测、酶切鉴定和序列分析,确定该毒株为血清4型禽腺病毒(FAdV-4),命名为SDTC20株。将该毒株接种LMH细胞增殖培养并建立了纯净稳定的种子批。为探究该毒株的致病性并确定该毒株的发病标准,对SPF鸡分别进行了不同接种途径、不同攻毒剂量、不同日龄以及对42日龄SPF鸡攻毒后发病规律观察的试验。根据试验结果确定血清SDTC20株的发病标准为:用7~56日龄SPF鸡10只,每只鸡肌肉注射稀释至含10^(5.0)TCID_(50)/0.1 mL的SDTC20株病毒液0.5 mL,观察7 d,攻毒鸡出现精神不振、羽毛粗乱、缩颈蹲伏等临床症状且剖检出现心包积液或肝脏肿大、出血、发黄等病理变化判为发病,攻毒鸡应至少90%发病且至少60%死亡。提示:SDTC20株可作为Ⅰ群FAdV-4相关生物制品有效性评价的标准强毒株,为后续产品研发奠定了毒株基础。

鸡cGAS基因的克隆、表达特性分析及FAdV-4感染前后亚细胞定位变化

cGAS作为一种新型的胞质DNA受体,在宿主抵抗DNA病毒而触发的天然免疫中起着至关重要的作用。血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)是无囊膜的一种双链DNA病毒,可引起鸡肝炎-心包积液综合征。为明确鸡cGAS(chcGAS)基因功能,探究在鸡肝癌(LMH)细胞中过表达chcGAS以及FAdV-4感染前后细胞定位的变化情况。本研究针对chcGAS序列设计引物进行PCR扩增,并分析该基因序列与其他物种之间的同源性以及预测该基因的结构域,构建重组质粒pET-32a-chcGAS进行原核表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定,利用激光共聚焦观察FAdV-4感染LMH细胞前后chcGAS细胞定位变化。结果表明,本试验克隆得到大小为1317 bp的chcGAS基因,与其他物种同源性为50.5%~84.4%,SDS-PAGE分析结果显示,chcGAS蛋白主要以可溶性蛋白质的形式在上清液处表达,目的蛋白质相对分子质量为75000,与预期大小相符。亚细胞定位结果显示,FAdV-4感染可导致定位于细胞核膜上的chcGAS蛋白转移到细胞质中。本研究结果为进一步研究FAdV-4与cGAS-STING信号通路的关联调控机制提供了科学依据。

全悬浮培养LMH细胞制备FAdV-4灭活疫苗的研究

通过对LMH细胞进行驯化,获得一株可全悬浮培养的LMH细胞,命名为LMH-S。此细胞可适应无血清、高密度悬浮培养,以初始细胞密度0.5×10^(6)/mL~1×10^(6)/mL接种,细胞密度最高达6×10^(6)/mL。研究确定生物反应器悬浮培养LMH-S细胞制备FAdV-4抗原的最优参数为:接毒时细胞密度2×10^(6)/mL~3×10^(6)/mL、接毒量0.1MOI~1MOI、接毒后48h~72h收毒,所获抗原病毒含量不低于10^(9.25)TCID_(50)/mL。试验鸡分别免疫0.02mL、0.05mL、0.1mL、0.3mL疫苗,攻毒保护率分别为9/10、10/10、10/10、10/10,表明疫苗有效性良好。本试验成功建立了LMH全悬浮培养细胞株,确定了FAdV-4抗原的生物反应器悬浮培养工艺,验证了悬浮培养抗原的免疫原性,为高效FAdV-4灭活疫苗的研制奠定了基础。

血清4型禽腺病毒感染LMH细胞后干扰素刺激基因在转录水平表达量的动态变化

【目的】了解鸡肝癌细胞(LMH)感染血清4型禽腺病毒(FAdV-4)后干扰素(IFN)和干扰素刺激基因(ISGs)的表达量变化,为研究FAdV-4与ISGs的相互作用提供参考依据。【方法】试验将FAdV-4感染LMH细胞,观察不同时间点细胞病变,并收集感染0、12、24、36、48、60、72、84和96 h的细胞样品,通过实时荧光定量PCR技术检测感染病毒后不同时间点IFN-α和IFN-β及ISGs基因在转录水平上表达量的动态变化规律。【结果】LMH细胞感染FAdV-448 h时出现典型的细胞病变;在感染12 h后,FAdV-4快速增殖,60 h时达到峰值;感染病毒后各时间点,与对照组相比,IFN-α基因转录水平表达量均显著下调(P<0.05);与对照组相比,在感染后12和24 h,IFN-β基因表达量显著下调(P<0.05),在36 h时迅速上调表达至峰值(P<0.05),在48 h时仍维持在较高水平,之后时间点的表达量有所下降且趋于稳定,但仍显著高于对照组(P<0.05);ISG 12、IFIT 5及DDIT 4基因在感染前期变化不大,在感染后36 h时迅速上调,在感染后96 h达到峰值(P<0.05);ZFP 313、IFITM 3及Viperin基因在感染前期表达量变化不大,随后在36 h迅速上调表达至峰值(P<0.05),在48 h时仍维持在较高水平,之后时间点的表达量有所下降,但仍显著高于对照组(P<0.05);与对照组相比,CD 47、OAS和PKR基因均呈现下调表达。【结论】在FAdV-4感染LMH细胞后,IFN及多种ISGs在转录水平呈现规律性变化,与病毒在LMH细胞中复制存在一定的联系,表明这些天然免疫因子可能在抗FAdV-4反应中发挥着重要作用。

禽腺病毒4型Penton和Fiber1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

为开展禽腺病毒4型(FAdV-4)五邻体蛋白(Penton)和纤丝蛋白(Fiber1)多克隆抗体的制备及评价,研究通过对Penton和Fiber1基因优势抗原表位基因片段进行生物信息学分析,设计特异性引物PCR扩增获得Penton和Fiber1优势抗原表位基因片段,将其克隆至原核表达载体pColdⅠ,转入表达宿主菌BL21(DE3)进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,将纯化、鉴定后的目的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,对抗体进行Western blot鉴定及间接ELISA抗体效价测定。结果可见,FAdV-4 Penton基因序列共编码525个氨基酸,Fiber1基因序列共编码432个氨基酸,其优势抗原表位点分别有7、6个区域,且均集中于N端;成功构建pColdⅠ-P和pColdⅠ-F1重组原核表达质粒,其诱导表达的重组蛋白Penton和Fiber1均与His标签单抗发生特异性反应,动物免疫获得的Penton、Fiber1多克隆抗体均能与目的蛋白反应形成特异性条带,且Penton多克隆抗体效价高于Fiber1多克隆抗体。综上,研究获得的纯化重组蛋白Penton较Fiber1蛋白表达量更高,免疫后血清抗体效价更高,更具有制备多克隆抗体的优势。

鹌鹑源FAdV4 Fiber 2、ORF29区序列分析及其致病性研究

本实验室前期在鹌鹑中分离到了1株4型禽腺病毒(FAdV-4)HB1812株,为了解该病毒全基因组序列和致病性,进行了全基因组测序和致病性实验。结果显示:HB1812株与国内的FAdV-4型流行毒株HN151025和JSJ13株的同源性最高,Fiber 2序列中G219A/D、E230Q、S260T、I299V、S304A、P307A、V319I、A380T、S389T、A400G、Q403Q、S406I、T412S、T434S、D438E、S452A、A458N和V477L位点存在点突变,ORF29区缺失了RMITPLYTRPP共11个氨基酸;致病性试验结果,HB1812株对SPF鸡具有致病性,可见典型的心包积液及肝脏发黄等临床症状,HE镜检可见心肌纤维排列紊乱及部分心肌断裂,心肌间隙可见大量红细胞,肝脏可见炎性细胞浸润并伴随少量肝细胞坏死。该研究是国内首次报道鹌鹑源禽腺病毒,为我国FAdV-4的传播方式、灭活疫苗的研制奠定基础。

绿原酸对FAdV-4的抑制作用及其对鸡胚肝脏炎性因子和信号分子表达的影响

试验旨在研究绿原酸对禽腺病毒4型(FAdV-4)的抑制作用及其对鸡胚肝脏炎性因子和信号分子表达的影响。将9日龄SPF鸡胚随机分为7组:对照组、5个不同浓度的绿原酸组和FAdV-4感染组。绿原酸组经尿囊腔注射不同浓度的绿原酸,48 h后与FAdV-4感染组均经尿囊腔接种0.2 mL ELD_(50)为1.36×10^(7)拷贝的FAdV-4病毒,对照组注射等体积的生理盐水。用MTT法检测绿原酸的安全浓度(IC_(50)),计算每枚鸡胚接种绿原酸的含量;接种病毒后72 h后,剖检并无菌收集鸡胚肝脏进行病理观察,实时荧光定量PCR法检测病毒载量,ELISA法测定肝脏细胞因子白介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及信号分子磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、核转录因子-κB(NF-κB)和NF-κBp65含量。MTT法测定结果表明,绿原酸对鸡胚成纤维细胞的IC_(50)为28.6μg/mL,每枚鸡胚接种0.2 mL的绿原酸含量分别为858、429、214.5(≈215)、107.25(≈107)和53.125(≈53)μg。FAdV-4病毒接种72 h后,FAdV-4感染组鸡胚肝脏边缘钝圆、肿大,变脆,呈土黄色或黄色,甚至出现坏死;随着绿原酸浓度增加,绿原酸组鸡胚肝脏肿胀渐不明显,坏死灶和出血瘀点减少;肝脏内病毒明显增殖,载量为7.8 log_(2)拷贝/mg,107μg绿原酸即可显著抑制FAdV-4在鸡胚肝脏中的增殖(P<0.05)。炎性细胞因子检测结果表明,与对照组相比,FAdV-4可极显著增加鸡胚肝脏中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量(P<0.01);53μg绿原酸组IL-1β和TNF-α含量极显著增加(P<0.01),107μg绿原酸组IL-6和TNF-α的含量均显著增加(P<0.05)。与FAdV-4感染组相比,107μg绿原酸组IL-1β和TNF-α的含量均极显著降低(P<0.01),215和429μg绿原酸组IL-6的含量显著降低(P<0.05),858μg绿原酸组IL-6的含量极显著降低(P<0.01)。细胞信号分子检测结果表明,与对照组相比,FAdV-4可极显著增加PI3K、NF-κB和NF-κBp65的含量(P<0.01);53μg绿原酸组PI3K、NF-κB和NF-κBp65的含量均显著增加(P<0.05)。与FAdV-4感染组相比,53μg绿原酸PI3K和NF-κBp65的含量均显著降低(P<0.05);215μg绿原酸组NF-κB的含量显著降低(P<0.05),NF-κBp65的含量极显著降低(P<0.01);当绿原酸达429μg时,PI3K、NF-κB和NF-κBp65的含量均极显著降低(P<0.01)。本试验结果表明,绿原酸能够抑制FAdV-4的增殖,且剂量依赖性地抑制炎性因子和信号分子的表达,说明绿原酸可用于鸡抗病毒和炎性相关疾病的防控。

血清4型禽腺病毒penton蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备和鉴定血清4型禽腺病毒(FAdV-4)五邻体(penton)蛋白单克隆抗体,为深入探究penton蛋白在FAdV-4感染致病机制中的作用及为抗原检测试剂研发提供抗体材料。【方法】以原核表达的FAdV-4 penton重组蛋白免疫6~8周雌性BALB/c小白鼠,加强免疫3次后,取鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,通过penton-酶联免疫吸附剂测定(ELISA)和FAdV4 virus-ELISA方法分别筛选阳性杂交瘤细胞株,对筛选出的单克隆抗体杂交瘤细胞株进行亚类鉴定、特异性和广谱性鉴定及间接免疫荧光和稳定性试验。【结果】亚类鉴定结果表明,筛选获得7株能稳定分泌抗FAdV-4 penton蛋白的杂交瘤细胞株(1D11、2B3、2C4、2C9、6B3、8F12和8G11),其轻链均为Kappa链,重链3株为IgG1,4株为IgG2b;特异性检测结果表明,7株单克隆抗体只与FAdV-4反应,不与其他11种血清型FAdV及NDV、ARV、EDSV和IBV等常见禽病病原体发生交叉反应;广谱性鉴定结果表明,7株单克隆抗体均可与19株FAdV-4分离株结合,广谱性好;间接免疫荧光试验结果表明,7株单克隆抗体均与感染FAdV-4的鸡胚肝细胞(CEL)结合,出现明亮的绿色荧光。对筛选出的3株单克隆抗体(6B3、8F12和8G11)进行稳定性检测,发现其稳定性良好。【结论】通过单克隆抗体制备和鉴定获得3株与FAdV-4蛋白结合效果较好并具有特异性和广谱性的FAdV-4 penton蛋白杂交瘤细胞株(6B3、8F12和8G11),能稳定分泌penton蛋白单克隆抗体,为深入研究penton蛋白在FAdV-4感染致病机制中的作用提供单抗,为FAdV-4抗原检测试剂的研发打下基础。

FAdV-4感染对SPF鸡血清生化指标的影响

由Ⅰ群禽腺病毒C种4型(FAdV-4)引起的鸡安卡拉病是近年来在中国广泛流行的一种急性、烈性传染病。为了解FAdV-4感染对鸡血清生化指标的影响,将分离鉴定的FAdV-4肝病毒液接种于易感日龄SPF鸡复制病理模型,同时设立对照,观察临床症状和病理变化,采集血液测定血清生化指标。结果表明:感染组与对照组相比,血液中总胆红素、直接胆红素、间接胆红素均极显著升高(P<0.01),总蛋白和白蛋白显著下降(P<0.05),葡糖糖含量和谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶活性以及肌酐与尿酸水平均极显著上升(P<0.01)。说明FAdV-4感染可引起鸡肝功能、肾功能受损,导致血清生化指标发生明显变化。

GPV·MDPV和FAdV-4三重PCR检测方法的建立

[目的]为快速地鉴别鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)和禽腺病毒血清4型(FAdV-4)3种病毒,建立一种特异强、敏感高、重复性好的三重PCR检测方法。[方法]根据Genbank登录的MDPV、GPV和FAdV-4的基因序列,设计3对特异性引物,以提取的核酸为模板,进行PCR特异性、敏感性和重复性试验。[结果]采用所建立的方法能够扩增出GPV、MDPV和FAdV-4特异性片段,且不能检出鸭黄病毒(DFV)、鸭I型肝炎病毒(DVH-Ⅰ)和禽呼肠孤病毒(ARV);GPV、MDPV和FAdV-4核酸模板的最低检测量分别为20、2、2 pg;对8份阳性临床病料进行检测,可见MDPV、GPV和FAdV-4的检出率均为100%。[结论]建立的三重PCR检测方法能够对MDPV、GPV和FAdV-4这3种病毒进行快速、准确的诊断。

饲粮精氨酸水平对肉仔鸡免疫功能及其抗FAdV-4影响的研究

本试验旨在研究饲粮精氨酸水平对肉仔鸡免疫功能及其抗禽腺病毒I群4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)的影响。选取1日龄罗斯(Ross)308肉仔鸡300只,随机分为5组(每组5个重复,每个重复12只),设置5个饲粮精氨酸水平组,分别为0.96%、1.20%、1.44%、1.68%和1.92%,试验鸡饲养至21日龄,各重复随机选取4只测定血清免疫指标和免疫相对器官指数。随后各重复再次随机选取6只,并分为感染组和对照组,感染组肌肉注射FAdV-4 NP毒株0.2 mL(TCID50=10-6.23/0.01 mL),对照组肌肉注射等量灭菌生理盐水,感染2 d后,统计死亡率、发病率,ELISA测定肝组织iNOS水平、qPCR测定肝iNOS mRNA表达量及病毒载量。结果表明:1)饲粮精氨酸水平为1.44%、1.68%和1.92%时,均能显著提高脾脏指数(P<0.05)且精氨酸水平为1.68%能显著提高胸腺指数(P<0.05),而精氨酸水平为0.96%会显著降低脾脏、胸腺和法氏囊指数(P<0.05)。2)1.68%精氨酸水平组能显著提高血清球蛋白(GLO)、IgG水平和球蛋白/白蛋白(G/A)比值(P<0.05);精氨酸水平为0.96%显著降低血清球蛋白和IgG水平(P<0.05)。3)精氨酸水平为0.96%可显著降低肉仔鸡血清中IL-1β、TNF-α、iNOS和NO水平(P<0.05),而1.68%和1.92%精氨酸水平组均能显著提高肉仔鸡血清中IL-1β、TNF-α、IFN-γ和iNOS水平(P<0.05)。4)肉鸡感染FAdV-4后,0.96%精氨酸水平组的死亡率会显著高于1.20%、1.44%、1.68%和1.92%组(P<0.05)。5)ELISA测定结果显示,1.44%、1.68%和1.92%精氨酸水平组能显著提高感染后的肝组织iNOS水平。6)1.44%、1.68%和1.92%精氨酸水平组均能显著提高肝iNOS mRNA表达水平(P<0.05);肉鸡感染FAdV-4,iNOS mRNA水平均会显著降低(P<0.05),1.44%、1.68%和1.92%精氨酸水平组能提高感染FAdV-4后肝iNOS mRNA水平(P<0.05)并显著降低肝的病毒载量(P<0.05)。由此可见,肉仔鸡饲粮中精氨酸的不足会降低其机体的免疫功能及抗FAdV-4病毒能力。提高肉仔鸡饲粮中精氨酸水平不仅能提高免疫器官指数、血清免疫因子水平及肝iNOS mRNA表达水平,降低肝的病毒载量,从而提高机体免疫功能和抗病毒能力。

FADV-4环介导等温扩增-HNB可视化检测方法的建立和应用

为了建立简便、快速的FADV-4环介导等温扩增(LAMP)可视化检测方法,试验以FADV-4高度保守的基因序列hexon基因为靶基因设计了6条引物,对反应体系的Mg^2+浓度、Bst DNA聚合酶用量、反应温度、反应持续时间进行优化,考察了优化体系的灵敏度及特异性。同时用建立的FADV-4 LAMP及LAMP-HNB可视化的检测方法对临床模拟样品进行检测。结果表明:当Mg^2+浓度为6 mmol/L、Bst DNA聚合酶浓度为320 U/mL、反应温度为65℃、反应时间为60 min、HNB使用浓度为120μmol/L时反应最优。LAMP最低DNA检测浓度为1.46 pg/μL,灵敏度是PCR的100倍,临床模拟样品LAMP、LAMP-HNB检测结果与普通PCR检测结果完全符合。说明所建立的FADV-4 LAMP-HNB可视化检测方法适用于临床的快速诊断。

麻黄鸡ALV-J、FAdV-4、FWPV混合感染的诊断

为了确定贵州省某规模养殖场病鸡发病的原因,本试验对发病鸡进行了临床剖检,取其鸡冠、肝脏、心脏、脾脏和肾脏等病料组织进行了细菌分离培养,并进行了鸡痘病毒(FWPV)、J亚型禽白血病病毒(ALV-J)和血清4型禽腺病毒(FAdV-4)的PCR检测。结果显示:实验室剖检可见病鸡存在鸡冠痘状结痂、肝脏肿瘤结节、心包积液、脾脏肿大等症状;细菌分离培养无菌落形成;基于ALV-J gp85、FAdV-4 penton、FWPV TK基因片段的PCR检测均呈阳性;随后的ALV-J gp85、FAdV-4 penton、FWPV TK基因克隆及序列分析进一步揭示了3种病毒的遗传进化状况。因此,送检病鸡确诊为ALV-J、FAdV-4、FWPV混合感染,依据确诊结果向有关养殖场提出了合理的防治措施建议。