斑马鱼Fbxl5基因多克隆抗体的制备与检测

Fbxl5为F-box基因家族的一员,目前研究发现其与心脏的发育有关。为了在斑马鱼模型中进一步研究该基因的功能,有必要制备其多克隆抗体。通过桥式PCR扩增出亲水性和特异性均好的斑马鱼Fbxl5基因片段,将其克隆入表达载体pET-28a,转化至大肠杆菌Rosseta中。用IPTG诱导Fbxl5重组质粒得到His-Fbxl5的融合蛋白。这个融合蛋白用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的His-Fbxl5融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。使用Western Blot检测,获得了Fbxl5原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Fbxl5多克隆抗体。随后检测了Fbxl5在斑马鱼胚胎和成体组织中蛋白的表达,通过基因芯片分析在Fbxl5-MO和Std胚胎样品的mRNA含量差异.所得结果显示获得了较高效价和特异性好的斑马鱼Fbxl5多克隆抗体,为Fbxl5功能的进一步研究奠定了基础。

针对Fbxl5基因关键结构域F-box的Crispr/Cas9打靶有效性分析

为了在动物体内研究Fbxl5基因是通过什么机制导致斑马鱼心脏出现突变表型,本文利用近几年兴起的CRISPR/Cas9打靶技术建立斑马鱼Fbxl5基因敲除品系。本文将打靶位点定位于Fbxl5的F-box结构域,也就是Fbxl5的第五号外显子上。首先经过基因打靶网站分析筛选出针对Fbxl5基因F-box结构域最适合的打靶位点,扩增出Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶双链DNA,并转录为RNA,与Hcas9共注射至斑马鱼胚胎。最后,在注射48 h后对Fbxl5基因CRISPR/Cas9打靶的有效性进行检测。首先在注射48 h之后收集胚胎提取基因组DNA,用特异性引物进行PCR扩增;将纯化后的Fbxl5基因PCR产物连接到p MD18-T载体,再经质粒提取,测序分析,通过与WT斑马鱼基因组序列进行比对发现Fbxl5-9号在PAM序列AGG下游缺失了4个碱基。证明该CRISPR/Cas9系统在敲除心脏发育候选基因Fbxl5是有效的,该研究为最终获得Fbxl5基因敲除斑马鱼奠定了良好的基础。

FBXL5在结肠癌中的表达及临床意义

目的:通过研究E3泛素连接酶FBXL5在结肠癌组织中的表达情况,来确定和探讨其临床意义。方法:采用免疫组化方法检测20例癌旁组织及60例结肠癌组织中E3泛素连接酶FBXL5的表达情况。结果:FBXL5在结肠癌和癌旁组织中表达差异有统计学意义(P<0.0 5),其阳性率分别为8 3.3%(5 0/6 0)、25.0%(5/20)。FBXL5的表达与结肠癌的淋巴结转移(P=0.027)和临床TNM分期(P=0.013)有关。FBXL5表达与术后5年生存率明显相关(P=0.016)。Cox多因素分析显示TNM分期为结肠癌的独立预后因素。结论:FBXL5促进了结肠癌的发生、发展、侵袭及转移,希望本次研究结果能对结肠癌的治疗及发生机制提供一个方向,为后续的生物学研究及临床治疗提供一个参考。

E3泛素连接酶FBXL5与恶性肿瘤关系的研究进展

泛素化修饰是蛋白质降解的信号，调节体内蛋白质翻译后修饰的重要途径之一，密切参与细胞周期、信号转导、DNA修复、免疫反应、一录调控等。泛素化修饰中的泛素连接酶与肿瘤的发生、发展密切相关。泛素化修饰被3种关键酶共同介导，其中E3泛素连接酶介导活泛素分子从结合酶E2转移到底物，不同的泛素连接酶靶向不同的底物蛋白，决定泛素化修饰的特异性，故E3连接酶于泛素化修饰中具有至关重要作用，已成为当前研究、探讨的热点问题之一。

FBXL5在乳腺癌细胞侵袭和转移中的作用研究

目的研究E3泛素连接酶FBXL5在乳腺癌组织及细胞中的作用及其可能机制。方法(1)WB及RTPCR检测FBXL5在不同分子分型的乳腺癌、癌旁组织细胞中的表达情况;(2)构建慢病毒LV-FBXL5转染MDAMB-231细胞,过表达FBXL5;(3)Transwell小室实验及划痕实验研究过表达FBXL5对乳腺癌细胞的侵袭迁移能力的影响。结果(1)FBXL5的mRNA和蛋白水平在乳腺癌组织、MDA-MB-231细胞系中表达均降低(P<0.05);(2)在MDA-MB-231细胞中转染慢病毒LV-FBXL5可以过表达FBXL5;(3)FBXL5过表达能够抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的侵袭及迁移。结论FBXL5可能为乳腺癌的EMT治疗提供潜在治疗靶点。

FBXL5:一种维持细胞内铁稳态的泛素连接酶

细胞内铁稳态的维持主要通过铁调节蛋白(ironregulatory protein,IRP)与几种铁代谢基因如转铁蛋白受体和铁蛋白mRNA上铁应答元件结合来实现。铁不足可增加IRP2活性和含量,而铁过载则诱导了IRP2的泛素化和蛋白降解。F-盒蛋白FBXL5是一种铁和氧依赖的E3泛素连接酶,在铁和氧存在的情况下催化IRP2的泛素化,而缺铁或缺氧则造成FBXL5自身被泛素化修饰和随后的蛋白酶体降解。FBXL5铁调节功能的发现使人们对细胞内铁稳态的理解更为清晰。

铁代谢与蛋白质泛素化-降解调控研究进展

铁元素为几乎所有的生命体所必需,维持铁代谢稳态对机体的正常功能至关重要。铁代谢紊乱与人类多种疾病的发生和发展有关。已知铁代谢稳态受到一系列参与铁代谢环节的关键蛋白质,如IRP2等的精确调节。这些重要蛋白质的稳定性、生理活性的动态变化及其协调作用是细胞维持铁代谢平衡的分子基础。除了转录和转录后水平的调控,泛素化等翻译后修饰方式和蛋白质降解是细胞精确调控参与铁代谢的蛋白质的水平及功能普遍而有效的方式之一;同时,细胞的铁代谢状态也影响细胞内参与泛素化等翻译后修饰途径的酶类的活性和稳定性,从而在铁代谢和蛋白质修饰-降解途径之间形成反馈机制,实时和动态地完成对细胞内铁代谢水平的精确调控。就相关领域的最新进展作简要综述。

硝普钠对SH-SY5Y细胞中F-box富含亮氨酸重复蛋白5和铁调节蛋白2表达的调节作用（英文）

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)患者早期铁选择性聚集在黑质致密带,残存的多巴胺能神经元内铁含量增高,说明铁升高可能是PD发生的一个关键因素。铁调节蛋白(iron regulatory proteins,IRPs)IRP1和IRP2可与铁转运和储存蛋白中的铁反应元件相结合,对维持细胞铁稳态起重要作用。F-box富含亮氨酸重复蛋白5(F-box and leucine-rich repeat protein 5,FBXL5)通过泛素蛋白酶体途径降解IRP2而参与铁代谢的调控。有研究显示一氧化氮(nitric oxide,NO)能够增强IRP1的活性,但对IRP2的表达影响尚未明确。本研究选择NO的供体硝普纳(sodium nitroprusside,SNP)作为处理药物,研究其对体外培养的SH-SY5Y细胞内FBXL5和IRP2蛋白表达的影响。细胞活力检测结果显示SNP可剂量依赖性地损伤SH-SY5Y细胞,降低细胞存活率。流式细胞术结果显示,经过100和300μmol/L的SNP处理后,细胞线粒体膜电位分别降低45%和60%。此外,Western blotting结果显示300μmol/L SNP能够引起细胞内FBXL5的蛋白表达量升高39%,而使IRP2的蛋白表达量降低46%。以上结果提示,SNP可造成SH-SY5Y细胞的线粒体功能障碍,并上调FBXL5的表达和下调IRP2的表达。