菜心BrcuFCA基因的克隆与表达分析

本文以菜心(Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.)Makino var.utilis)为实验材料,比较了Trizol法、改进Trizol法及改良SDS法提取菜心总RNA的效果。结果表明改进Trizol法集中了操作简单、耗时短、所需试剂种类少,且完整性好,产量和纯度均高等多重优点,成为提取菜心总RNA首选方案。同时文章以甘蓝型油菜及其它物种的FCA保守区设计引物,将质量高的菜心总RNA反转录合成cDNA,通过RT-PCR从菜心的早、晚熟品种中均克隆得到与开花有关的基因片段,将之命名为BrcuFCA,片段长1001bp,GenBank登录号为EU700363,与甘蓝型油菜及拟南芥FCA氨基酸同源性分别达到了98%和82%。另一方面,本研究还利用半定量RT-PCR研究了BrcuFCA不同时空表达特性,并结合已发表的开花调控遗传途径中两个关键基因BrcuFLC和BrcuFRI时空表达特性研究结果,推测菜心主要的抽薹开花途径不是春化和FRI-依赖途径,而很可能是自主开花途径。本研究为菜心抽薹开花分子机理的研究提供理论依据。

桂花OfFCA基因的克隆及在花芽分化时期的表达分析

【目的】桂花Osmanthus fragrans是著名的香化植物,其花芽分化受到环境温度影响。研究环境温度对桂花花芽分化的影响对桂花的花期调控具有重要的指导意义。【方法】以桂花品种‘堰虹桂’O.fragrans‘Yanhonggui’为材料,采用石蜡切片观察其花芽分化进程,运用聚合酶链式反应和实时荧光定量技术对影响温度FCA(FLOWERING LOCUS CA)基因分别进行克隆及表达特异性分析。【结果】克隆得到OfFCA cDNA序列长为1319 bp,其开放阅读框为864 bp,编码287个氨基酸。序列比对及进化分析发现:OfFCA与木犀科Oleaceae油橄榄Olea europaea和胡麻科Pedaliaceae芝麻Sesamum indicum的FCA相似度较高,同源性可达68%以上。在桂花花芽分化的不同时期,无论叶还是花芽中,19℃环境低温下OfFCA基因的表达水平均显著高于25℃常温生长条件下的表达水平。【结论】桂花OfFCA基因响应环境相对低温的变化,参与桂花的花芽分化,使桂花的花期提前。

铁皮石斛FCA基因的表达及生物信息学分析

FCA(FLOWERING CONTROL LOCAL A)基因是自主开花途径中促进植物开花的保守基因。通过电子克隆和末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)从铁皮石斛中克隆得到FCA基因全长cDNA序列,命名为DoFCA。生物信息学分析显示DoFCA基因开放阅读框为2301 bp,包含19个外显子,18个内含子,编码766个氨基酸残基的蛋白,在N-端(131~210、220~298)有两个RRM结构域,C-端(605~634)存在一个WW结构域。启动子分析发现,该基因启动子区存在与分生组织特异激活、胚乳表达、花药特异基因的表达调控密切相关的调控元件。蛋白序列同源性分析表明,保守区域主要集中在两个RRM结构域和WW结构域部分,表明该蛋白在不同物种中功能保守。系统发育分析显示DoFCA蛋白与石斛类FCA蛋白的进化关系最近,并且发现FCA蛋白在单子叶和双子叶植物进化过程中出现了分化。对DoFCA-WW/FY-PPLPP复合物的分析发现WW结构域中的14Tyr、16Tyr、23Ser及25Trp 4个位点与FY-PPLPP相互作用最紧密,并且23Ser和FY-PPLPP基序的第2个Pro残基形成氢键。逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析结果显示,DoFCA在铁皮石斛花组织中的表达有优势,在根中表达最少,茎、叶组织中表达量其次。在低温处理12 h时后,其表达量迅速下降,随后表达量又逐渐升高,最后维持在较高水平。表明该基因与铁皮石斛花的发生和形成可能具有重要作用;在低温诱导开花过程中也发挥作用。

春性甘蓝型油菜FCA同源基因可变剪接体的克隆及表达研究

【目的】克隆特早熟春性甘蓝型油菜的FCA同源基因(sBnFCA)及其可变剪接体,并分析该基因的表达模式。【方法】根据拟南芥和芸薹属植物FCA基因的DNA序列和cDNA序列设计引物,用PCR和RT-PCR技术克隆特早熟春性甘蓝型油菜"86号"的FCA同源基因(sBnFCA)及其可变剪接体,对克隆基因及编码蛋白序列进行生物信息学分析,构建系统进化树,并用qRT-PCR技术检测sBnFCA基因在不同发育时期根、茎、叶、茎尖中的表达量。【结果】克隆出了sBnFCA基因的全长序列(8 827bp),得到了sBnFCA-γ可变剪接体及一个新的可变剪接体(sBnFCA-5),新的可变剪接体在GenBank中的登录号为KJ701579.1。sBnFCA-5剪接体的CDS全长1 986bp,编码662个氨基酸残基,其推导的氨基酸序列具有2个保守的RRM结构域和1个WW结构域。生物信息学分析显示,sBnFCA-5与已报道甘蓝型油菜BnFCA-γ(AF414188.1)的相似性达99%,与拟南芥FCA-γ的相似性达87%。sBnFCA-5比sBnFCA-γ少了172个碱基序列,是一个跨外显子剪接体。sBnFCA蛋白相对分子质量和理论等电点分别为72.5ku和9.2。基因表达模式分析显示,sBnFCA-γ和sBnFCA-5在苗期、蕾期、花期的根、茎、叶和茎尖组织中都有表达,sBnFCA-γ在蕾期茎尖和花期叶片中表达量较高,sBnFCA-5在蕾期茎尖和花期叶片中表达量极高。【结论】克隆的sBnFCA-5为甘蓝型油菜sBnFCA基因的一个新的可变剪接体,该基因在春性特早熟甘蓝型油菜开花调控中可能有着重要的调节作用。