UHPLC-MS/MS法考察FGF21-164融合蛋白在小鼠体内的药代动力学

FGF21-164是通过对内源性FGF21多肽的结构修饰、偶联得到的融合蛋白,拟用于治疗肥胖引起的糖脂代谢紊乱。本文通过Skyline软件预测得到该蛋白经胰蛋白酶酶解后的候选肽段质谱信息,采用高分辨质谱法验证预测的候选肽段。通过优化超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)法分析条件,选择具有最佳质谱响应的FGF21-164特征替代肽段(YLYTDDAQQTEAHLEIR)。血清样品经磷酸缓冲液稀释后, 60℃变性并烷基化,在37℃下与胰蛋白酶孵育2 h直接酶解产生替代肽段,该肽段在质谱ESI正离子模式检测下,产生特征离子对,即三电荷的母离子m/z 689.3和单电荷的子离子m/z 738.4。色谱分离使用含0.1%甲酸的水溶液(A相)和0.1%甲酸的乙腈溶液(B相),在EclipsePlus C18柱(2.1 mm×50 mm, 1.8μm)上进行,以多反应监测模式对上述离子对监测,以外标法定量分析小鼠血清中FGF21-164融合蛋白的浓度。该方法在2.50~500μg·mL^(-1)内呈良好的线性关系(r=0.998 8),定量下限为2.50μg·mL^(-1)。该方法成功应用于FGF21-164融合蛋白在小鼠体内的药代动力学研究。动物实验经中国科学院上海药物研究所实验动物伦理委员会(批号:20180004040450)批准。药动学实验结果表明,相比于内源性FGF21, FGF21-164融合蛋白在小鼠体内的t1/2由0.5 h延长至2.6 h,有望延长该蛋白的疗效。

人骨保护素-分枝杆菌热休克蛋白70融合蛋白的克隆与表达及其活性鉴定

目的:为解决类风湿性关节炎中骨破坏及炎症损伤两大难题,拟克隆人骨保护素功能区与分枝杆菌热休克蛋白70肽段融合基因,进一步观察其在大肠杆菌中的表达并鉴定活性。方法:实验于2006-05/2007-09在首都医科大学免疫学系实验室完成。采用反转录-聚合酶链反应技术从人骨肉瘤细胞系MG63总RNA中扩增骨保护素成熟肽段编码区基因,构建pGEM-TEasy-骨保护素重组质粒。以此为模板,聚合酶链反应扩增骨保护素-热休克蛋白70功能区DNA,构建重组表达载体pET-28a-骨保护素-热休克蛋白70,将其转化E.coli.BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷诱导后收集菌体蛋白,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白免疫印迹鉴定该融合蛋白的表达,以破骨细胞生长抑制实验及抑炎实验检测该融合蛋白的生物学活性。结果:①实验最终获得人骨保护素全长基因片段,人骨保护素-热休克蛋白70功能区DNA片段已被正确插入到pET-28a载体中,转化菌株可表达人骨保护素-热休克蛋白70融合蛋白。②十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示约在Mr22000处有蛋白的超表达,而未诱导菌株未发现有此条带。③蛋白免疫印迹检测表明,融合蛋白能与抗人骨保护素单克隆抗体特异性结合。④破骨细胞生长抑制实验表明,该融合蛋白能够减少破骨细胞的生成数量,具有体外抑制骨破坏的生物活性。⑤抑炎实验表明,融合蛋白具有显著减轻迟发型超敏反应小鼠模型炎症反应程度的作用,说明融合蛋白中热休克蛋白70具有抑制炎症的生物学活性。结论:在E.coli.BL21(DE3)中表达了骨保护素-热休克蛋白70融合蛋白,体外功能实验证实该融合蛋白具有一定的生物学活性。

马铃薯X病毒载体介导的人成纤维细胞生长因子21(hFGF21)在烟草中的表达

【目的】利用马铃薯X病毒(PVX)表达载体(pgR107),在本氏烟草中表达人成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21,FGF21),旨在寻求一种低成本、方便、安全,且保持hFGF21蛋白生物活性的方法。【方法】将包含组氨酸(His)标签序列的hFGF21-smGFP融合基因和hFGF21基因克隆进PVX表达载体,构建重组表达质粒pgR107-His-hFGF21-smGFP和pgR107-His-hFGF21。采用冻融法将质粒pgR107-His-hFGF21-smGFP、pgR107-smGFP和pgR107-His-hFGF21转入根瘤农杆菌GV3101中,通过农杆菌介导注射侵染接种本氏烟的叶片,采用SDS-PAGE、Western blotting和ELISA检测hFGF21-smGFP和hFGF21蛋白的表达情况。烟草叶片表达的融合蛋白经Ni-NTA柱纯化后,再用重组牛肠激酶(rbEK)裂解,获得纯度较高的重组hFGF21活性蛋白。hFGF21调节葡萄糖吸收活性用微量化的GOD-POD法检测。【结果】成功构建了植物病毒双元表达载体pgR107-His-hFGF21-smGFP和pgR107-His-hFGF21。表型观察发现,侵染第7天,烟草外源蛋白积累最高,smGFP和hFGF21-smGFP蛋白的积累主要在细胞质中。SDS-PAGE、Western blotting和ELISA分析表明,hFGF21重组蛋白可在烟草中有效表达,表达量高达500μg/g(鲜叶质量)。生物活性检测结果表明,纯化的hFGF21蛋白可以促进3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的吸收。【结论】利用PVX病毒载体,在本氏烟草中表达的重组hFGF21蛋白具备生物活性。

重组rHSA-hFGF21融合蛋白在毕赤酵母中的表达纯化及活性分析

人成纤维细胞生长因子21(human fibroblast growth factor 21,hFGF21)已成为改善血糖和脂质代谢的候选药物,但却存在半衰期短和易被体内代谢等缺点,导致靶组织利用率低,限制了其临床应用。本研究通过柔性连接肽(GGGGS)_(3)将hFGF21的N端连接至人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的C端,经过毕赤酵母密码子优化后,将重组基因片段rHSA-hFGF21连入pPIC9k和pPICZαA两种载体,并转化到X33、GS115和SMD1168三种不同酵母菌株中。通过加压筛选得到高表达的X33-pPIC9K-rHSA-hFGF21工程菌株,并优化摇瓶诱导条件如OD值、甲醇浓度和诱导时间进一步提高rHSA-hFGF21的表达效率。培养上清经中空纤维膜切向流技术粗分离、Blue亲和层析和Q离子交换层析纯化获得纯度约98.18%的rHSA-hFGF21蛋白。与hFGF21相比,rHSA-hFGF21具有更好的热稳定性和抗胰蛋白酶降解的能力,其血浆半衰期也延长了约27.6倍;中高浓度条件下rHSA-hFGF21刺激HepG2细胞摄取葡萄糖的能力优于hFGF21;在2型糖尿病动物中rHSA-hFGF21比hFGF21具有更好的长效降糖效果。本研究将为FGF21蛋白的大规模生产奠定基础。

人内皮抑素endostatin基因的融合表达纯化及活性测定

目的:获得有活性的人内皮抑素(endostatin)融合蛋白. 方法:从人胎肝组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出endostatin基因,定向克隆重组入pTRX表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达,纯化,MTT法测定endostatin蛋白对人脐带静脉血管内皮细胞的抑制活性. 结果:RT-PCR获得endostatin基因,扩增产物在10 g/L 琼脂糖凝胶上显示为1条扩增条带,约573 bp,与预计大小一致.将PCR产物连入PGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,阳性克隆经KpnⅠ,NotⅠ酶切鉴定、测序验证.构建pTRX-endo表达载体,在大肠杆菌BL21 (DE3)中的表达,经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,大小与预期相符合.重组蛋白经纯化,MTT 法测定重组人内皮抑素蛋白具有生物学活性.人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)受到明显抑制,具有剂量依赖抑制关系,ED50=550μg/L. 结论:人内皮抑素基因在原核细胞表达载体pTRX中获得成功表达,表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖.

Syncytin与滋养细胞融合

Syncytin是人类内源性逆转录病毒HERV W基因编码的膜糖蛋白,主要在胎盘合体滋养细胞表达。Syncytin可促进滋养细胞的融合,它的表达异常与妊娠高血压综合征、21- 三体综合征等病理妊娠有关。