FHL2通过NF-κB信号通路调节THP-1巨噬细胞泡沫化

目的 明确4个半LIM结构域蛋白(FHL2)是否能够通过调节核因子κB(NF-κB)信号通路影响巨噬细胞泡沫化。方法 构建FHL2过表达质粒及合成FHL2小干扰RNA(si-FHL2),分别转染至人单核/巨噬细胞系THP-1中,Western blot检测FHL2表达;使用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激细胞,ELISA检测细胞IL-6、IL-1β、TNF-α等细胞因子的表达;油红O染色检测细胞泡沫化程度;Western blot检测NF-κB信号通路相关蛋白表达。结果 转染过表达FHL2质粒的细胞中FHL2表达量升高(P<0.01),而转染si-FHL2的细胞表达量降低(P<0.05);敲低FHL2能够下调炎性细胞因子的分泌(P<0.01);FHL2下调能够缓解THP-1巨噬细胞泡沫化;同时,FHL2下调抑制NF-κB信号通路的活化(P<0.05),而在过表达FHL2组中结果呈相反趋势。结论 下调FHL2的表达可通过抑制NF-κB信号通路活化,降低炎性细胞因子的分泌,缓解巨噬细胞的泡沫化。

牦牛FHL2基因的克隆、组织表达与蛋白定位分析

旨在获得牦牛FHL2基因序列,阐明该基因序列、蛋白质结构与性质、mRNA的组织表达模式、在雌性生殖器官及颗粒细胞的蛋白表达特性。本研究以5头健康空怀成年母牦牛的心、肝、脾、肺、肾、卵巢、子宫、输卵管组织及5头妊娠2个月左右母牦牛的子宫、输卵管和卵巢为研究材料,利用逆转录PCR(RT-PCR)技术克隆FHL2基因,并使用在线分子生物学软件分析其生物信息学特性;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析FHL2基因的组织表达特性;应用免疫组化(IHC)和免疫荧光(IF)技术检测FHL2蛋白在雌性生殖器官的分布和颗粒细胞上的亚细胞定位。结果发现,FHL2基因CDS区全长840 bp (ON456866),编码279个氨基酸,FHL2蛋白属于弱碱性亲水不稳定蛋白,没有跨膜结构。不同物种的FHL2氨基酸序列比对和进化树分析表明,FHL2基因编码区在物种进化中比较保守。RT-qPCR结果显示,FHL2基因在检测的组织都有表达,在心的表达量极显著高于其他检测组织(P<0.01);在肺、卵巢、输卵管和子宫中的表达量极显著高于肝、脾和肾(P<0.01)。FHL2基因在妊娠期子宫中的表达量极显著高于空怀期(P<0.01),在卵巢中妊娠期的表达量极显著低于空怀期(P<0.01)。IHC结果表明,在生殖器官中FHL2蛋白主要在卵泡颗粒细胞、子宫内膜和输卵管黏膜表达;IF定位结果显示,FHL2蛋白主要分布在卵泡颗粒细胞的细胞核中。综上所述,牦牛FHL2基因在动物进化过程中比较保守,在心、肺、卵巢、输卵管和子宫中表达量高,可能在参与牦牛低氧适应性、卵泡发育和妊娠维持等生理功能的调控中发挥重要作用。

贵州白山羊FHL3基因多态性与生长性状关联分析

筛选贵州白山羊FHL3基因单核苷酸变异位点(SNPs),并分析基因多态性与生长性状的关联性,为培育贵州白山羊优良品系提供参考依据,也为进一步研究FHL3基因生物学功能奠定基础。通过混合池测序对116只不同地区贵州白山羊FHL3基因进行SNPs鉴定,以188只贵州白山羊进行关联性分析。采用PopGene32.0软件计算等位基因频率、基因型频率、遗传纯合度(H_(o))、期望杂合度(H_(e))、有效等位基因数(N_(e)),应用PIC软件计算群体多态性信息含量(PIC),以卡方(χ~2)检验分析基因Hardy-Weinberg平衡状态;应用MINTAB软件中的一般线性混合效应模型分析核苷酸变异与生长性状关联性。结果表明,贵州白山羊FHL3基因的6个检测区域中,仅在P3区域检测到1个核苷酸变异位点g.215 C/T,且该位点的H_(o)低于H_(e),PIC检测为中度多态,χ~2检验结果表明,该位点偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)。关联分析结果表明,贵州白山羊FHL3基因g.215 C/T位点变异构成的不同等位基因和基因型在体高、体长和胸围方面表现出显著差异性(P<0.05),存在等位基因C的群体和CC基因型群体具有更高的生长优势。贵州白山羊FHL3基因具有一定的多态性,且g.215 C/T位点变异与体高、体长和胸围具有显著相关性,可作为培育贵州白山羊优良品系的候选基因分子标记。

FHL1与泌尿系肿瘤发生发展关系的研究进展

四个半LIM结构域基因1(FHL1)蛋白含有四个半LIM结构域,LIM结构域通过调节蛋白相互作用来参与肌动蛋白细胞骨架重构和转录等过程。FHL1在大多数前列腺癌和膀胱癌组织中低表达,与前列腺癌的发生、转移和耐药相关,与膀胱癌的迁移和侵袭相关,参与肿瘤进展。在肾细胞癌中,不同病理类型的肾细胞癌组织中FHL1表达水平不同,不同肾乳头状细胞癌亚型的FHL1表达水平不同。希佩尔-林道综合征患者肾透明细胞癌病灶的FHL1表达水平与病灶大小相关,FHL1及其剪接变体可能通过抑制Notch信号通路参与低Fuhrman分级(≤2级)肾乳头状细胞癌的产生。本文对FHL1在泌尿系肿瘤中的研究进展作一综述。

应用CRISPR/Cas9技术敲除甲状腺乳头状癌B-CPAP细胞FHL1基因及转录组分析

目的 探究FHL1在甲状腺瘤细胞中参与的细胞生物学功能,为后续研究FHL1基因介导甲状腺癌发生发展的分子机制提供依据。方法 运用CRISPR/Cas9基因编辑技术在甲状腺乳头状癌B-CPAP细胞系中大片段敲除FHL1基因,CCK-8实验测定B-CPAP^(FHL1-/-)细胞活率,细胞划痕实验计算B-CPAP^(FHL1-/-)细胞迁移率,抽提B-CPAP细胞和B-CPAP^(FHL1-/-)细胞RNA用于转录组高通量测序,并进行表达差异基因KEGG与GO富集分析。结果 实验结果显示B-CPAP细胞中FHL1基因缺失35 995 bp,导致蛋白功能被破坏。B-CPAP^(FHL1-/-)细胞与B-CPAP细胞相比增殖速率、迁移能力加快。B-CPAP与B-CPAP^(FHL1-/-)细胞转录组高通量测序分析结果表明,与B-CPAP细胞相比,B-CPAP^(FHL1-/-)细胞蛋白编码基因表达量分析检测到1 813个差异基因,其中1 125个基因上调,688个基因下调。KEGG通路富集分析发现细胞外基质受体交互作用、肿瘤信号通路、细胞黏附分子信号通路基因表达明显较高,这3条信号通路对肿瘤信号转导、侵袭及转移具有重要作用。对差异表达基因进行GO富集分析,发现上述3条信号通路的多种上调和下调表达基因。结论 B-CPAP^(FHL1-/-)细胞可能通过胞外基质受体交互作用、肿瘤信号通路、细胞黏附分子等信号通路上调相关基因表达,从而提升细胞增殖、迁移能力。

HOXD13、FHL1和先天性马蹄内翻足的相关研究

为研究HOXD13、FHL1和先天性马蹄内翻足的关系,应用变性梯度凝胶电泳技术检测HOXD13基因在先天性马蹄内翻足个体中的突变,应用半定量RT-PCR及免疫组织化学技术检测HOXD13、FHL1在先天性马蹄内翻足患者肌肉组织中的表达;并用软件预测FHL1基因上游HOXD13的结合位点,凝胶阻滞试验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证HOXD13和FHL1的相互作用。结果84例先天性马蹄内翻足患者中未发现HOXD13基因编码区突变存在。与同期正常足部肌肉组织相比HOXD13(33.3%),FHL1(46.6%)在先天性马蹄内翻足患者肌肉组织中表达明显下调。EMSA结果表明,当HOXD13存在时出现特异的DNA阻滞条带。上述结果说明:HOXD13的编码区突变可能不是先天性马蹄内翻足发生的原因,而HOXD13和FHL1表达水平的改变可能与马蹄内翻足畸形的发生有关,HOXD13可能通过直接调控FHL1发挥作用。

FHL1在人胰腺癌族中的表达及其与胰腺癌的侵袭及转移的相关性研究

目的:探讨FHL1蛋白在胰腺癌组织中的表达及其与胰腺癌临床病理特征的关系。方法:利用Western blot检测62例胰腺癌手术切除标本与其相对应的癌旁胰腺组织中FHL1蛋白的表达。用Logrank检验分析FHL1蛋白表达与预后的关系。结果:FHL1的蛋白表达在胰腺癌中与对应癌旁胰腺组织相比下降明显(0.197±0.042 vs.0.508±0.272,P<0.01)。同时,FHL1在胰腺癌中的表达与临床分期、病理分级、淋巴结转移、肿瘤累及范围、远处转移均有明显差异(P<0.05),与高表达FHL1组相比,低表达FHL1组患者术后生存时间明显缩短(P<0.01)。结论:FHL1的异常表达很可能与胰腺癌的侵袭、转移等密切相关,而这种异常表达又影响了胰腺癌患者的预后。

FHL1抗体的制备与特异性鉴定

目的:制备FHL1及其剪接体FHL1B、FHL1C的多克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法:融合表达GST-FHL1蛋白,常规免疫小鼠,制备多克隆抗体。分别构建带有FLAG标签的FHL1-5、FHL1B、FHL1C以及FHL1N端和C端缺失突变体的真核表达载体。Westernblot检测抗体的特异性。结果:获得了FHL1-5、FHL1B、FHL1C及FHL1(1-169aa)和FHL1(168-280aa)的真核表达载体;得到的多克隆抗体可特异识别FHL1、FHL1B和FHL1C,而不识别FHL2-5;抗体与FHL1N端反应,而不与其C端反应。结论:成功得到可特异识别FHL1、FHL1B和FHL1C的多克隆抗体,为进一步研究FHL1及其剪接突变体的功能奠定了坚实的基础。

低氧性肺动脉高压大鼠肺内FHL1的表达

目的了解低氧肺动脉高压时肺内FHL1与肺血管重建的关系。方法将20只雄性Wistar大鼠分为对照组和低氧肺动脉高压组,低氧肺动脉高压组以常压低氧复制大鼠肺动脉高压模型,以微导管法测定各组大鼠肺动脉压,采用免疫组织化学法检测各组大鼠肺内FHL1、细胞骨架蛋白1(Talin1)及细胞周期素D(Cyclin D)的表达,对肺组织切片进行图像分析。结果低氧3周后,低氧肺动脉高压组大鼠形成明显的肺动脉高压,管壁增厚,管腔狭窄,大鼠肺动脉压(2.86±0.39)kPa,右心室肥厚指数[RV/(LV+S)]为(43.53±3.38)%,管壁厚度占外径的百分比(WT%)为(35.24±11.2)%,管壁面积占血管总面积的百分比(WA%)为(55.09±12.38)%,分别与对照组[(1.35±0.28)kPa、(23.68±3.48)%、(23.63±9.74)%和(41.62±12.83)%]相比升高(P<0.01);肺小动脉FHL1免疫阳性染色在低氧肺动脉高压组大鼠为1.48±0.03,与对照组(0.86±0.02)相比增强(P<0.01);低氧肺动脉高压组大鼠Talin1免疫阳性染色为(1.52±0.04),与对照组(0.92±0.03)相比增强(P<0.01);低氧肺动脉高压组大鼠Cyclin D免疫阳性染色为(1.46±0.02),与对照组(0.73±0.04)相比增强(P<0.01)。结论低氧所致FHL1的合成增多在低氧性肺血管重建和肺动脉高压的发病过程中起一定的作用,其作用可能与Talin1、Cyclin D有关。

FHL-1及FHL-2在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的检测FHL-1及FHL-2在胃癌组织中的表达情况,探讨FHL-1及FHL-2与胃癌相关临床病理因素的关系。方法采用免疫组化SP法检测35例胃癌和20例切缘正常组织中FHL-1及FHL-2表达。结果FHL-2蛋白在胃癌组织及正常胃黏膜组织中的阳性表达率分别为88.57%、20%,两者之间差异有统计学意义(P<0.05),且表达程度与临床病理因素无明显相关性(P>0.05)。FHL-1蛋白在正常组织及胃癌组织中阳性表达率分别为80.00%、34.29%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论FHL-1和FHL-2可能在胃癌的发生、发展过程中起着重要的作用。

siRNA抑制FHL2对胃肠癌细胞β-catenin活性的影响

目的本研究旨在调查通过siRNA抑制FHL2表达后对β-catenin活性及其下游基因sur-vivin表达的影响,探讨两者在肠癌发生中的协同作用。方法 (1)PCR扩增含有β-catenin作用位点、长为340bp的survivin基因启动子片段,克隆入PGL3-basic载体,构建荧光素酶报告质粒pluc340。(2)脂质体瞬时转染法将β-catenin活性报告质粒pTOPFLASH、pFOPFLASH和pluc340转染入胃肠癌及正常细胞株,双荧光素酶法测定其启动子活性,并评价其对fhl2siRNA的反应。(3)RT-PCR方法检测基因表达。结果成功构建了survivin启动子片段pluc340;荧光素酶活性检测显示:β-catenin转录活性在胃肠癌细胞明显高于正常细胞;siRNA抑制FHL2表达后,β-catenin转录活性下降,survivin表达降低。结论抑制FHL2的表达能够降低β-catenin转录活性及下游癌基因的表达,干扰Wnt信号通路,说明fhl2有望成为肠癌治疗的新靶点。

FHL1在胃癌中的表达及其临床意义

目的观察肿瘤抑制因子FHL1在人胃癌组织中的表达,并探讨其与胃癌预后的关系。方法应用组织芯片技术和免疫组织化学方法检测1072例胃癌术后癌组织中FHL1的表达,并分析其与癌浸润深度、分化、分期等病理特征及预后之间的相关性。结果 FHL1在分化高、中和低、未分化的胃癌组织中阳性表达率分别为58.4%和24.9%(P<0.001);FHL1在T1、T2期和T3、T4期胃癌组织中的阳性表达率分别为60.3%和38.3%(P<0.001);FHL1在淋巴结转移阴性和阳性的胃癌组织中阳性表达率分别为59.0%和37.6%(P<0.001);FHL1在TNM分期中Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期胃癌组织中的阳性表达率分别为58.8%和35.3%(P<0.001);生存分析表明FHL1是判断胃癌患者预后的独立指标。结论 FHL1表达与人胃癌的浸润深度、组织分化、淋巴结转移、TNM分期和预后相关,并可能参与人胃癌发生发展的过程。

FHL1在新辅助化疗后乳腺癌组织中的表达变化及临床意义

目的研究经新辅助化疗(NCT)的乳腺癌组织中抑癌基因FHL1表达的变化及临床意义。方法对76例多西他赛联合吡柔比星新辅助化疗前后的乳腺癌标本进行FHL1检测,最终69例化疗前标本和63例化疗后检测结果纳入评价,前后配对的标本共59例,对新辅助化疗前后FHL1的表达率和表达强度进行比较。结果化疗前FHL1阳性率为79.7%,化疗后阳性率为65.1%。化疗后FHL1表达增强17例,不变12例,下调30例,配对等级资料检验证明FHL1在化疗后表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论多西他赛加吡柔比星新辅助化疗后FHL1表达下降。新辅助化疗降低FHL1表达可能会对部分患者的预后产生不良影响。

FHL2抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖与侵袭生长的机制探讨

目的探讨FHL2对分化抑制蛋白1(Id1)的转录调控活性及Id1促乳腺癌细胞侵袭生长效应的影响。方法采用共转染双荧光素酶相对活性检测方法检测乳腺癌MCF-7细胞中FHL2对Id1介导的转录抑制功能的影响,MTT方法检测细胞的增殖能力,Transwell方法观察细胞的侵袭能力。结果Id1对碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子E47介导的转录激活功能具有显著抑制作用,而FHL2明显削弱了该效应,并呈现出对FHL2转染剂量的依赖性;与空载体转染组比较,Id1明显促进了MCF-7细胞的增殖速率与侵袭能力,而该效应可被FHL2显著削弱(P<0.05)。结论FHL2可通过抑制Id1的功能活性来抑制乳腺癌细胞的增殖及侵袭生长,为深入研究FHL2-Id1信号途径在乳腺癌发生发展中的功能效应奠定了基础。

FHL2抗体的制备及其在癌细胞和组织中表达的检测

目的:制备FHL2特异性的多克隆抗体,并检测FHL2在癌细胞和组织中的表达。方法:在大肠杆菌中融合表达GST-FHL2蛋白,纯化后免疫小鼠,制备多克隆抗体。采用Western blot检测抗体的特异性,并检测FHL2在乳腺癌细胞、肝癌细胞和小鼠组织中的表达。结果:获得了可特异识别FHL2,而不识别FHL家族其他成员的多克隆抗体;FHL2蛋白在乳腺癌和肝癌细胞株中表达;FHL2在心脏、肌组织、乳腺、前列腺和肝脏组织中都有表达。结论:成功地得到可特异识别FHL2的多克隆抗体,且发现FHL2在癌细胞和更广泛地正常组织中都有表达,为进一步研究FHL2在凋亡、癌变、分化等生命过程中的功能奠定了基础。

FHL2通过相互作用抑制Id2的功能活性

分化抑制蛋白2(Id2)通过抑制碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)类转录因子的功能活性调控多种组织细胞的分化发育,并参与人类多种肿瘤的发生与进展.Id2相互作用蛋白可能调控其翻译后的功能活性.本研究以HLH结构域缺失的Id2作为诱饵蛋白,采用酵母双杂交方法对MCF-7 cDNA文库进行筛选,识别了1个新的Id2相互作用蛋白FHL2(属于LIM蛋白家族的一员),哺乳动物双杂交实验系统验证了Id2与FHL2之间的相互作用,同时证实,该作用不依赖于Id2中的HLH结构域;GST-pulldown、免疫共沉淀方法,进一步证实FHL2/Id2之间的相互作用;免疫荧光共定位实验结果证实,FHL2/Id2相互作用主要发生在细胞核内;共转染实验结果发现,FHL2通过相互作用阻抑了Id2对bHLH类转录因子E47的功能抑制活性.总之,本研究识别了1个新的Id2相互作用蛋白FHL2,通过直接的相互作用,FHL2抑制了Id2的功能活性,FHL2可能参与调控Id2介导的细胞分化与发育过程,并可能参与肿瘤的发生与进展.

FHL1和Smad4在结直肠癌中的表达及与肝转移的关系

目的探讨FHL1和Smad4在结直肠癌组织中的表达及与结直肠癌肝转移的相关性。方法选择结直肠癌患者112例,分为肝转移组及无肝转移组,应用免疫组织化学法检测FHL1和Smad4在结直肠癌及癌旁组织中的表达,分析两者在结直肠癌中的表达情况,及与肝转移的相关性。结果在结直肠癌组织中,FHL1的阳性表达率为20.5%(23/112),在癌旁组织中阳性表达率为94.6%(106/112),Smad4在两种组织中的阳性表达率分别为14.3%(16/112),96.4%(108/112),差异均有统计学意义(P均<0.05);无肝转移组中Smad4和FHL1的阳性表达率明显高于肝转移组中Smad4和FHL1的阳性表达率,差异有统计学意义(均P<0.05)。单因素分析结果提示结直肠癌临床分期、淋巴结转移、FHL1及Smad4表达与肝转移相关(均P<0.05),多因素logistic回归分析显示FHL1及Smad4蛋白表达是结直肠肝转移的独立危险因素。Spearman相关分析显示FHL1蛋白表达与Smad4呈正相关(r=0.462,P<0.05)。结论结直肠癌中FHL1及Smad4低表达与肝转移相关,是结直肠癌肝转移的独立影响因素,可作为预测结直肠癌肝转移的生物学指标。

KISS1、KAI1和FHL1在乳腺癌组织中的表达及其与肿瘤转移的关系

目的研究转移抑制基因KISS1、KAI1和FHL1在淋巴结转移与否的乳腺癌组织中表达的差异及其与雌、孕激素受体的关系。方法应用组织芯片和免疫组织化学EnVision法检测59例乳腺癌组织和31例非癌组织中的KISS1、KAI1和FHL1表达情况及其与乳腺癌临床病理特征的关系。结果①乳腺癌中KISS1、KAI1和FHL1的表达与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。②KISS1、KAI1和FHL1表达与乳腺癌的腋窝淋巴结转移、临床分期呈负相关,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与患者年龄、肿瘤大小无关,差异无统计学意义(P>0.05)。③KAI1表达与ER、PR呈负相关(P<0.05);FHL1表达与PR呈负相关(P<0.05);差异均有统计学意义。④分析KISS1、KAI1和FHL1之间的关系可以看出:两两之间呈正相关,差异有统计学意义(P<0.01)。结论有淋巴结转移的乳腺癌患者KISS1、KAI1和FHL1的表达明显低于无淋巴结转移的乳腺癌患者。

FHL家族的克隆及其融合蛋白的纯化

目的:纯化FHL家族(FHL1～FHL5)融合表达蛋白。方法:用PCR方法从乳腺文库和卵巢文库中扩增FHL1～FHL5编码序列,将其以正确相位与pGEX-KG载体中的GST编码序列融合,将重组质粒分别转化E.coliDH5α后,用谷胱甘肽-Sepharose4B纯化融合蛋白,并用Westernblot检测融合蛋白的表达。结果:构建得到FHL1～FHL5的融合表达载体,West-ernblot检测表明GST-FHL1～GST-FHL5共5种融合蛋白均成功表达,并纯化得到融合蛋白。结论:成功克隆FHL1～FHL5基因,并得到纯化的融合蛋白。

利用RNAi抑制FHL2基因的表达

目的:构建FHL2基因的siRNA真核表达载体,观察其对FHL2蛋白表达的影响。方法:利用RNAi干扰技术,设计并合成了两条针对FHL2基因的siRNA,将其克隆到siR-NA表达载体pSliencer 2.1-U6 neo上。将重组质粒和带FLAG标签的FHL2共转染293T人胚肾细胞,通过Western blot实验检验RNAi干扰效应。结果:经过酶切和测序证明,成功构建了FHL2 siRNA真核表达载体。通过Western blot证明,构建的siRNA能有效抑制FHL2基因的表达。结论:成功地构建了FHL2基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效地抑制FHL2基因的表达。