LIM结构域蛋白FHL1C与GNB2不存在相互作用

目的通过哺乳动物双杂交及免疫共沉淀技术验证经质谱技术获得的LIM结构域蛋白FHL1C相互作用候选分子GNB2与FHL1C之间是否存在相互作用,从而丰富FHL1C调控Notch信号通路的机制。方法分别构建融合质粒p CMVGAL4-DBD-FHL1C和p CMV-VP16-GNB2,并将其共转染He La细胞,通过哺乳动物双杂交实验验证两者在细胞内是否具有相互作用;构建带Flag标签的GNB2融合蛋白的重组载体p CMV-Flag-GNB2,酶切鉴定正确后,与带myc标签的FHL1C融合蛋白的重组真核表达载体p CMV-myc-FHL1C共转染He La细胞,利用免疫共沉淀技术检测GNB2与FHL1C之间是否存在生理上的相互作用。结果哺乳动物双杂交实验和免疫共沉淀实验均显示:FHL1C与GNB2之间不存在生理上的相互作用。结论成功构建了实验所需的GNB2的融合蛋白真核表达重组载体,利用哺乳动物双杂交实验及免疫共沉淀技术证实FHL1C与GNB2之间不存在相互作用。

LIM结构域蛋白FHL1C抑制Notch信号途径的转录激活研究

目的:克隆人表达FHL1C基因以及建立真核表达载体和慢病毒载体。方法:从人的骨骼肌细胞来源的cDNA中扩增并克隆人FHL1C基因的编码区,连接至pMD-18T载体酶切鉴定后测序。序列测定确认后,双酶切pMD18T-FHL1C回收片段,插入真核表达载体,构建真核表达载体pCMV-Myc-FHL1C酶切鉴定正确后,转染Hela细胞及Cos7细胞,用Western Blot检测其在转染细胞中的表达,用双荧光素报告基因系统检测其对Notch信号作用。构建FHL1C-IRES-GFP表达单元,建立慢病毒表达载体plen-ti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒后感染培养的细胞,用免疫荧光显微镜、Western Blot检测分析其在被感染的细胞中的表达。结果:通过PCR方法成功扩增了人FHL1C基因的编码区。通过转染Hela及Cos7细胞,使用Western Blot检测其蛋白水平表达,双荧光报告基因系统分析均能够下调激活的Notch信号。成功构建了FHL1C慢病毒表达载体pLenti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒,把获取的慢病毒感染细胞后通过荧光显微镜证实被感染的细胞绿色荧光蛋白正确表达,Western Blot检测证实其表达。结论:成功建立起FHL1C真核表达载体及慢病毒表达系统,为研究急性T淋巴细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础。