利用CRISPR/Cas9技术构建能克隆难度序列的Stbl2^(TM)菌株

Stbl2^(TM)菌株适合克隆不稳定的外源DNA片段,但该菌株易受噬菌体侵染,且在构建某些高拷贝质粒时,难以克隆成功。利用CRISPR/Cas9技术将Stbl2^(TM)菌株的抗噬菌体相关基因fhuA和控制拷贝数的基因pcnB进行编辑,降低克隆难度,提高克隆效率。针对2个基因分别设计sgRNA,构建含有sgRNA的质粒pTarget-fhuA和pTarget-pcnB,分别将2个质粒与pCas9-Red质粒转入Stbl2^(TM)菌株中,经菌落PCR和测序验证基因正确编辑后再将2个外源质粒消除,并将2 kb的线粒体基因组序列作为外源基因,转入菌株进行最终的功能验证。结果表明:fhuA基因被成功敲除103 bp,pcnB基因被成功敲除802 bp,将高拷贝pUC57质粒转入基因编辑后的Stbl2^(TM)菌株,可明显降低质粒的拷贝数,且能正确克隆线粒体基因难度序列。该研究构建的菌株可作为后续克隆难度序列的感受态使用,还可为难度序列的基因克隆提供借鉴方法。

抗噬菌体L-苏氨酸工程菌的选育及机理分析

试验通过常压室温等离子体诱变苏氨酸生产菌,筛选获得具有噬菌体抗性的苏氨酸基因工程菌株。从苏氨酸发酵染噬菌体发酵液中分离得到混合噬菌体(P-1)。以P-1为筛选因子,通过常压室温等离子体诱变苏氨酸生产菌YPT、抗性初筛、溶原性验证、噬菌体抗性遗传稳定性验证、发酵罐产酸等验证。结果显示:通过筛选得到1株对P-1具有稳定抗性的苏氨酸生产菌株,命名为YPT-1。在分子水平上对突变株YPT-1抗噬菌体的机制做初步研究。采用CRISPR技术进行敲除验证,证实fhuA基因的缺失可致使菌株获得噬菌体抗性。研究表明,经过初步产酸验证,此菌株产酸指标与对照株(诱变出发菌YPT)相比未下降,且产酸稳定,具有较好的工业化应用价值。

基于数据挖掘探究兰艾双香方诱导大肠杆菌K12菌株铁死亡机制研究

目的 本研究旨在通过数据挖掘探究兰艾双香方在发挥抑菌作用过程中,常见致病菌—大肠杆菌诱使铁死亡发生的过程,为后续开展常见致病菌发生铁死亡的研究提供基础研究方向和理论基础。方法以兰艾双香方中的各种中药在中国知网、万方数据、维普以及中药系统药理学数据库等检索有效成分及对应蛋白。建立中药数据的Excel表格,对有效成分、分子蛋白等进行分析,并分析药物蛋白在大肠杆菌K12菌株不同样本起作用蛋白,最后对在大肠杆菌K12菌株中铁死亡蛋白进行分析。结果 兰艾双香方中共138个活性化学成分,共获得兰艾双香方蛋白265个,其中“MG1655”样品中共有17个作用蛋白,“W3110”样本中共有5个作用蛋白,fhuA是在大肠杆菌K12抑菌过程中诱导大肠杆菌发生铁死亡的关键蛋白。结论 通过数据发掘的方式,发现兰艾双香方中存在的铁色素外膜转运蛋白在大肠杆菌铁死亡进程中发挥作用,为后续开展诱导常见大肠杆菌等常见致病菌发生铁死亡从而发挥抑菌作用提供了基础。