Ficoll密度梯度离心法分离猪外周血单个核细胞条件的探讨

目的探讨猪外周血单个核细胞(PBMC)最佳分离条件,为寄生虫免疫学研究提供有效的方法。方法使用猪淋巴细胞分离液,在不同离心转速和时间条件下分离猪PBMC,观察所得云雾状PBMC层的厚度,计算细胞得率及细胞活力,以确定猪淋巴细胞分离液分离猪PBMC的最佳实验条件。同时采用文献报道的人淋巴细胞分离液分离猪PBMC的分离条件(1500r/min,30min)分离猪PBMC,比较两者分离PBMC效果。结果使用猪淋巴细胞分离液(密度1.110ng/L),在20～25℃室温下以1500r/min(半径15cm)离心30min,接着低温(4℃)1500r/min离心10min,洗涤2次,这样获得的猪PBMC效果最好。同样条件下,用人的淋巴细胞分离液分离猪PBMC,不仅所得细胞沉淀中混杂细胞如红细胞及其他细胞碎片较多,而且PBMC细胞得率及活力也不好。结论本实验提出了获得大量有活力的猪PBMC的方法和条件。

犬骨髓间充质干细胞分离纯化和成骨诱导分化：Ficoll液密度梯度离心法体外分离的可行性

背景:目前骨髓间充质干细胞较经典的分离方法是Percoll密度梯度离心法,以去除血细胞成分,但该法操作较为复杂,分离犬骨髓时需要配制密度,且离心次数较多,对细胞损伤大。目的:拟建立可靠、高纯度的犬骨髓间充质干细胞体外分离纯化方法,并观察其在体外扩增、成骨诱导分化的能力。方法:于犬髂后上棘抽取骨髓液10mL,肝素抗凝,Hanks液稀释后,加入1.077g/mL Ficoll液3mL,2000r/min离心20min,吸取有核细胞形成白色云雾状的分层界面,用含胎牛血清的DMEM离心2遍,按12×104/cm2密度接种,于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养。细胞传代后,加入含地塞米松、β-磷酸甘油钠、L-2-磷酸抗坏血酸的DMEM成骨条件培养液进行诱导。免疫细胞化学染色和免疫荧光染色检测成骨细胞特征性分泌蛋白骨钙素、骨桥蛋白的表达,以及Ⅰ型胶原的表达,并进行碱性磷酸酶染色与茜素红染色。结果与结论:1.077g/mLFicoll液密度梯度离心法分离所得的有核细胞层相对于Percoll液分层明显,可获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,接种细胞生长良好,平均倍增时间为24h。犬骨髓间充质干细胞体外成骨诱导培养后,骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原均呈阳性表达,碱性磷酸酶染色后细胞胞浆呈蓝绿色,茜素红染色后细胞外基质中出现散在的红色结节,可在体外定向分化为成骨细胞。

碘克沙醇及Ficoll-400分离纯化大鼠胰岛细胞的效果对比

目的:分别使用碘克沙醇和Ficoll-400密度梯度液纯化大鼠胰岛细胞,比较两者分离纯化大鼠胰岛细胞的收获量、纯度、活性和功能.方法:将20只SD大鼠随机分为碘克沙醇纯化组和Ficoll-400纯化组,以胶原酶P消化分离SD大鼠胰腺,分别采用碘克沙醇及Ficoll-400密度梯度液来纯化胰岛细胞.通过DTZ染色,计数胰岛细胞的数量和纯度,用胰岛素释放试验和胰岛移植评估胰岛细胞的功能.结果:碘克沙醇-HCA液纯化组的胰岛细胞收获量及纯度与Ficoll-HCA无明显差别,碘克沙醇-HCA组纯化的胰岛细胞活率则显著高于Ficoll-HCA组(93.3%±3.5% vs 84.8%±3.8%,P<0.01),同时胰岛细胞逆转糖尿病大鼠高血糖状态的时间显著延长(11.4±2.1 vs 7.0±1.6 d,P<0.05).结论:与Ficoll-400相比,使用碘克沙醇纯化大鼠胰岛可提高胰岛细胞的活率及功能.

Ficoll分离液在Sephadex G-100微柱凝胶血型卡中的应用

目的 探讨Sephadex G-100微柱凝胶血型卡加入Ficoll分离液后的性能和应用.方法 在Sephadex G-100微柱凝胶血型卡中加入Ficoll分离液,制作成Ficoll分离液-微柱凝胶血型卡,对200例标本进行ABO和Rh（D）血型测定,并与进口的强生血型卡和Sephadex G-100血型卡法进行比对.分别用37℃孵育强生血型卡、45℃孵育强生血型卡和45℃孵育Ficoll分离液-微柱凝胶血型卡三种方法对6例低、中、高不同效价的冷凝集素标本进行ABO和Rh （D）血型测定,同时进行反定型血型检测.分别用强生血型卡、Sephadex G-100血型卡和Ficoll分离液-微柱凝胶血型卡对26例溶血标本进行ABO和Rh （D）血型测定.结果 自制Ficoll分离液-微柱凝胶血型卡检测200例标本的血型结果,A型55例,B型46例,O型92例,AB型7例,Rh （D）均为阳性,与强生血型卡和Sephadex G-100微柱凝胶血型卡结果相同.自制血型卡检测抗D抗体平均滴度为1：256,与Diana凝胶卡灵敏度相同,明显优于传统试管法（P＜0.05）.45℃孵育Ficoll分离液-微柱凝胶血型卡检测6例冷凝集素标本血型结果正确,正反定型一致,37℃和45℃孵育强生血型卡检测冷凝集素标本血型分别有3例和2例结果不正确,造成假阳性.Ficoll分离液-微柱凝胶血型卡检测26例溶血标本血型结果正确,强生血型卡和Sephadex G-100血型卡检测溶血标本血型分别有6例和10例结果不正确.结论 研制Ficoll分离液-Sephadex G-100微柱凝胶血型卡适用于血型鉴定.对于冷凝集和溶血标本血型鉴定有明显优势.该卡具有准确、灵敏、特异、试剂制备工艺简单、成本低等优点,具有较好的推广应用和开发价值.

Ficoll分离法富集脐带血自然杀伤细胞的实验条件分析

目的探讨影响Ficoll分离法富集脐带血(UCB)自然杀伤细胞(NK)的实验条件。方法在不同保存温度、复温时间、Ficoll密度和抗凝剂比例条件下,Ficoll法分离临床UCB,通过流式检测NK存活率、富集前后的回收率以及粒细胞清除率,评判富集效果。结果UCB在4、25、37℃下可保存至7h,随后UCB中NK存活率和富集回收率、粒细胞清除率随时间延长明显下降。对长时间保存的4℃脐血,可在不影响NK存活率情况下,通过复温37℃1h或适度增加Ficoll密度提升回收率。此外,血袋规格应与采集血量相匹配,否则较少血量会导致预留抗凝剂在UCB中的浓度变大,也会降低NK富集回收率。结论在保持UCB与抗凝剂正常比例情况下,临床UCB 37℃保存7h内进行Ficoll分离法富集NK可达到较好富集效果。

Ficoll密度梯度离心法分离腹水单个核细胞方法的优化

目的:使用Ficoll密度梯度离心法分离腹水单个核细胞,并对方法进行优化,以提高腹水单个核细胞分离的纯度。方法:收集腹水标本12份,每份标本离心富集细胞后均分为2份,分为常规组和优化组。常规组使用Ficoll分离液直接分离单个核细胞;优化组先将腹水用PBS缓冲液洗涤一次,再与Ficoll分离液进行两次分离。分离后用PBS缓冲液稀释到相同体积,使用计数盘计算细胞浓度,使用台盼蓝染色法计算活率以及使用瑞氏-姬姆萨复合染色法计算细胞纯度。结果:常规组细胞浓度低于优化组,差异有统计学意义(t=-2.268,P=0.044);两组活率差异无统计学意义(t=1.856,P=0.090);常规组纯度低于优化组,差异有统计学意义(t=-6.416,P=0.000)。结论:使用PBS洗涤一次后,再进行两次分离,可提高单个核细胞的数量和纯度,而活率不受影响。

马铃薯原生质体游离与培养体系的研究

普通马铃薯四倍体栽培种“甘农薯2号”、“Favorita敗ⅰ癛usset Burbank”试管苗叶片为材料来源,游离培养马铃薯原生质体。结果表明,游离前材料的低温预处理,酶解前对组织和酶液进行真空渗透处理,均能显著提高原生质体产量。用Ficoll密度梯度离心法收集原生质体进行培养,结果表明第三、四层界面的原生质体有较好的培养效果。培养液中加入10 %～15 % 的马铃薯提取液并进行愈伤组织看护培养,有良好的培养效果。

四种常用的人中性粒细胞分离方法的比较

目的:比较Percoll非连续密度梯度离心法、Ficoll-Hypaque密度梯度离心法、裂解红细胞法和Dextran作用下红细胞自然沉降法四种常用的人中性粒细胞分离方法。方法:取健康人外周静脉血,分别采用以上四种方法进行中性粒细胞分离,对其细胞纯度、回收率、存活率进行比较。结果:Percoll非连续密度梯度离心法与Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离得到的细胞纯度均大于90%,两者间比较无统计学差异(P>0.05);裂解红细胞法和Dextran作用下红细胞自然沉降法分离得到的细胞纯度略低于Percoll非连续密度梯度离心法(P<0.01)与Ficoll-Hypaque密度梯度离心法(P<0.05)。Dextran作用下红细胞自然沉降法的回收率低于Percoll非连续密度梯度离心法(P<0.01)、Ficoll-Hypaque密度梯度离心法(P<0.01)和裂解红细胞法(P<0.05);Percoll非连续密度梯度离心法回收的中性粒细胞存活率明显高于Ficoll-Hypaque密度梯度离心法(P<0.05),裂解红细胞法(P<0.01)和Dextran作用下红细胞自然沉降法(P<0.01)。结论:Percoll非连续密度梯度离心法分离中性粒细胞,纯化程度好,回收率高,是一种简单、高效的中性粒细胞分离方法,适于临床和科研中广泛应用。

骨髓间充质干细胞移植在小鼠脑梗死中的作用机制及对大脑HMGB1水平的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞移植在脑梗死小鼠中的作用机制及对大脑高迁移率族蛋白(HMG)B1水平的影响。方法(1)细胞分离、鉴定。选择入组C57小鼠5只,获得骨髓单个核细胞,传代后培养、备用;采用流式细胞仪完成骨髓间充质干细胞鉴定;(2)动物实验。选择入组C57小鼠40只,随机取小鼠10只,设为空白对照组;剩余30只小鼠采用线栓法完成脑梗死动物模型建立,建模成功后分为模型对照组、溶剂组与干细胞组各10只。假体手术组与空白对照组进行常规喂养,溶剂组注射5%200μl鼠血清的RPMI1640培养基,干细胞组注射骨髓间充质干细胞5×10~6个,干预后30 d比较各组神经功能缺损、炎症因子及HMGB1水平。结果(1)倒置显微镜下原代骨髓间充质干细胞形态不一,形状多为梭形;传代培养后第3代细胞增长迅速、排列具备一定的方向性,多呈旋涡状生长,但是细胞界限不清;流式细胞仪测定结果表明:分离获得的骨髓间充质干细胞CD3占1.4%,CD73为98.6%,CD90为99.1%,说明分离获得的细胞为骨髓间充质干细胞;(2)干细胞组干预后1 d、10 d、20 d、30 d神经功能缺损评分均显著低于溶剂组、模型对照组(P<0.05);溶剂组干预后1 d、10 d、20 d、30 d神经功能缺损评分均显著低于模型对照组(P<0.05);(3)干细胞组干预后30 d白细胞介素(IL)-6水平显著高于溶剂组与模型对照组(P<0.05);干细胞组干预后30 d IL-10、转化生长因子(TGF)-β水平均显著低于溶剂组与模型对照组(P<0.05);溶剂组干预后30 d IL-6水平显著高于模型对照组(P<0.05);溶剂组干预后30 d IL-10、TGF-β水平均显著低于模型对照组(P<0.05);(4)干细胞组HMGB1水平显著高于溶剂组与模型对照组(P<0.05);溶剂组HMGB1水平显著高于模型对照组(P<0.05)。结论将骨髓间充质干细胞移植用于小鼠脑梗死有助于减少神经缺损,降低炎症因子水平,能促进脑组织中HMGB1释放。

鸡胚生殖嵴中原始生殖细胞的分离培养

目的 在鸡胚孵化的 19期以Ficoll密度梯度离心和酶解离两种方法分离生殖嵴中的原始生殖细胞 (PGCs)。探索在生殖嵴中PGCs分离、培养的适宜方式 ,以获得较多数量与较高活力的PGCs作介导生产转基因鸡。方法 在倒置显微镜下进行形态观察 ,台盼蓝染色比较存活时间 ,PAS特异染色法识别鉴定PGCs。结果 两种分离方法均能分离到一定数量的PGCs细胞。与Ficoll密度梯度离心法相比 ,酶解离法分离到PGCs的相对数量较多 ,存活时间较长 ,是一种较可行的分离方法。在鸡胚孵化的第 19期 ,PGCs大量聚集在肢体后端的生殖嵴原基处 ,此时的生殖嵴大小已达一定程度 ,分离其中的PGCs操作简便 ,有较强的可操作性。结论 提取的PGCs为转基因鸡的生产提供了介导材料。

一种富集脐血造血干/祖细胞的简易方法

脐血造血干细胞的分离与冻存是建立脐血干细胞库、进行干细胞移植的关键。我们采用不同比重的淋巴细胞分离液（Ficoll液）经密度梯度离心法分离脐血单个核细胞（MNC），计数并用单抗经流式细胞仪进行表型分析。结果显示：每份脐血平均采集量为99.8±7.3ml，单个核细胞计数平均为（4．15±0．67）×106／ml；使用比重为1.064的Ficoll液比使用常规比重1．077的Ficoll液所分离的造血干细胞数量多，前者CD34+细胞百分数约为后者的3倍。

脉压对急性心肌梗死及冠状动脉介入术后内皮祖细胞内皮相关基因表达差异的影响

目的观察脉压(PP)对急性心肌梗死及冠状动脉介入术(PCI)后7 d内皮祖细胞(EPCs)内皮相关基因表达的影响。方法分别采集高PP(≥60 mm Hg,1 mm Hg=0．133 kPa)及低PP(≤40 mm Hg)急性前壁心肌梗死患者心肌梗死发生6 h内和急诊PCI后7 d的外周血。以Ficoll密度梯度离心法分离出单个核细胞(MNCs),在包被明胶的培养瓶内以M-199培养液培养并在刺激因子作用下,14 d后收集贴壁细胞,经鉴定为EPCs。抽提RNA,进行24个内皮相关基因在心肌梗死6 h和PCI后7 d表达差异的芯片检测,并以RT-PCR法进行验证。24个内皮相关基因分别为调节血管收缩舒张功能、血管新生和内皮细胞活性的相关基因:ACE、AGTR-1、AGTR-2、eNOS、COX-2、ET-1、ETA、ETB、SOD-1、CDH5、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、ICAM1、ICAM2、ICAM3、PECAM-1、E-Selectin、L+Selection、VCAM1、tPA、uPA、PAI和VWF。芯片图像通过Agilent Scanner获取,扫描像素值为10 m,PMT(％)数值为100。采用Zipf's law标准化统计方法实现高PP与低PP基因表达差异的比较。结果心肌梗死6 h及急诊PCI后7 d,高PP与低PP对基因表达的差异为: ETB(ETNRB)、ACE是共同下调基因, SOD-1、ETA、AGTR-1为共同上调基因。对上调差异表达基因AGTR-1、ETA及SOD-1进行RT-PCR验证也显示了相同结果。结论在心肌梗死导致内皮相关基因改变的基础上,PP作为独立因素可影响EPCs相关内皮基因的表达,即高PP较低PP使ETB(ETNRB)、ACE基因下调,SOD-1、ETA、AGTR1基因上调。

应用单克隆抗体检测猕猴淋巴细胞亚群

应用单克隆抗体检测淋巴细胞表面抗原,是近年来发展起来的一项新技术。这一方法特异性强,结果准确,已得到广泛重视。检测猕猴T细胞表面抗原可获得淋巴细胞分化和功能性亚群的资料,不仅有助于了解猕猴兔疫功能及其与疾病的关系,而且通过与人类T细胞表面抗原比较,在研究灵长类进化及其与人类亲缘关系上也有很大价值。现将我们采用免疫荧光方法检测猕猴T细胞亚群的结果报告如下。材料和方法1.研究对象健康猕猴14只,年龄3～8岁,雄性4只,雌性10只。2.试剂实验中采用的单克隆抗体列于表1,所有单克隆抗体及兔抗鼠异硫氰酸荧光素(FITC)荧光抗体均由史良如教授惠赠3.猕猴淋巴细胞的分离取猕猴静脉血2ml,肝素抗凝,加Ficoll-Hypaque(比重1.077)分层液,离心(1800rpm)20分钟,分离淋巴细胞后,用含5%

应用显微电影技术对白血病细胞活动及药物敏感性观察

目前在白血病研究中缺少对白血病细胞活动的动态跟踪研究的报导。我们应用显微电影技术,采用定格摄影的方法,连续地跟踪拍摄了白血病患者骨髓白血病细胞的活动性及其对化疗药物的敏感性,报道如下。材料和方法急性粒细胞白血病4例,正常对照3例,无菌条件下收集骨髓液,用Ficoll-Hypaque分离两次,再用RPMI 1640培养液冲洗两次。

LAK细胞在肿瘤免疫治疗中的研究进展

1985年,美国国家癌症研究院Rosenberg首次报道联合应用自体LAK细胞和白介素-2治疗晚期癌症患者,从临床总的治疗效果来看,对肾癌、恶性黑色素瘤、大肠癌、非何杰金氏淋巴瘤等有效。为治疗癌症开辟了一条新的途径。一、LAK细胞的制备 1.一般方法持续静注IL-2结束5天后,无菌抽提外周静脉血。

人骨髓间充质干细胞生物学特性及腺病毒介导的GFP标记

目的建立人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分离、培养以及鉴定的方法,同时应用腺病毒介导的绿色荧光蛋白(Ad-GFP)检测细胞转染的效率。方法应用人淋巴细胞分离液(Ficoll)对hMSCs进行分离,经贴壁纯化后用MTT法检测增殖能力;并对其成骨、成脂、成平滑肌诱导分别进行碱性磷酸酶(ALP)、油红O染色及α-SMA免疫细胞化学检测;采用流式细胞仪(FCM)检测细胞表面标志的表达。用Ad-GFP转染,并应用荧光显微镜与FCM检测转染效率。结果 hMSCs镜下为成纤维样形态,约在第4天进入对数增长期;分化诱导后ALP染色、Von kossa银染、油红O染色以及α-SMA均为阳性;FCM检测CD14、CD31、CD45表达阴性,CD44、CD73、CD106及PDGFRβ表达阳性;当感染复数MOI=200,细胞培养48h时感染效率较高,FCM检测显示为99.81%。结论经过对增殖、分化能力以及表面标志的分析,证明用Ficoll可以分离得到较纯的hMSCs,Ad-GFP可以很好地感染细胞,为组织工程种子细胞的体内示踪提供了途径。

突触体制备方法研究

突触（synapse）,即是指一个神经元与另一个神经元相接触的部位,突触是神经元之间在功能上发生联系的部位,也是信息传递的关键部位。由于其特殊位置和作用,突触是探讨脑功能的关键所在[1]。在现代神经生物学及众多其他学科的研究中,突触的作用日益得到重视。从中枢神经系统中分离出形态完整,活性较高的突触体是进行离体神经生理。

小鼠外周血单个核细胞分离、纯化

目的:探讨小鼠外周血单个核细胞(PBMC)最佳分离条件,提高细胞获得率与纯度,以便后续分子生物学实验。方法:小鼠摘除眼球取血,设置离心力、离心时间、实验环境温度等梯度优化,分别采用EDTA-K2、肝素、枸橼酸钠抗凝,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,直接进行贴壁培养和分析获得率、纯度,计数存活率。结果:Ficoll密度梯度离心法经条件优化后分离的PBMC纯度可达85%,细胞获得率最高可达80%以上,活细胞百分率在92%以上。结论:Ficoll密度梯度离心法在优化条件下可有效地分离PBMC,对后续分子生物学实验无影响。

分离外周血单个核细胞的条件优化

目的比较不同抗凝剂、离心力及离心时间对葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll)密度梯度离心法分离单个核细胞的影响,优化实验方案。方法取肝素、EDTA及2种抗凝剂混合后的3种不同抗凝血,采用Ficoll法进行分离,用血细胞分析仪进行分类和计数,计算回收率和纯度;同时对EDTA抗凝血进行不同离心力及离心时间的处理,优化分离效果。结果 EDTA组获得PBMC回收率为(51.32±50.21)%,纯度为(45.38±22.14)%;肝素组获得PBMC回收率为(24.52±19.10)%,纯度为(78.46±11.91)%;EDTA+肝素组获得PBMC回收率为(56.32±24.30)%,纯度为(80.27±12.44)%。经单因素方差分析,PBMC回收率方面,EDTA组与肝素组比较差异有统计学意义(P<0.05),EDTA组回收率较高,而肝素+EDTA组与EDTA组回收率比较,差异无统计学意义(P>0.05);PBMC纯度方面,EDTA组与肝素组比较差异有统计学意义(P<0.05),肝素组PBMC纯度较高,而肝素+EDTA组与肝素组比较,纯度则差异无统计学意义(P>0.05);PBMC存活率方面,肝素+EDTA组与肝素组、EDTA组比较,均差异无统计学意义(P>0.05)。对EDTA抗凝血进行单个核细胞分离实验表明,在离心力为600×g(1 800r/min),离心时间为25min时分离效果最佳。结论肝素+EDTA组回收率、纯度与单种抗凝剂实验组相比,结果差异无统计学意义(P>0.05),故在实验过程中可以混合两种抗凝全血进行细胞分离。EDTA抗凝血在离心力为600g(1 800r/min)、离心时间为25min时,分离单个核细胞效果最佳。