嵌合蛛丝蛋白Flag-MaSp1重复模块的表达及二级结构分析

蜘蛛能够产生7种具有不同机械性能的丝纤维及胶状物质。其中,鞭状腺丝(flagelliform silk)具有最好的弹性,拖丝(dragline silk)具有最高的强度。本文将来源于大腹园蛛(Araneus ventricosus)鞭状腺丝蛋白(flagelliform spidroin,Flag)的一个重复模块与组成拖丝的蛋白质之一的主壶腹腺丝蛋白1(major ampullate spidroin,MaSp1)的一个重复模块相融合。经原核表达得到的嵌合蛛丝蛋白FlagR-MaSp1R在施加剪切力的作用下可自组装形成丝状纤维。圆二色谱分析显示,在pH 7.0溶液中,FlagR-MaSp1R蛋白的二级结构以α-螺旋为主;傅里叶变换红外光谱分析结果表明,FlagR-MaSp1R形成丝纤维时二级结构由α-螺旋向β-折叠转变;扫描电镜观察结果显示,嵌合丝纤维表面光滑,直径为1~2μm,接近天然丝纤维。上述结果为制备特定功能的嵌合蛛丝纤维提供了理论基础及方法支持。

使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因RNA干扰的有效靶点

【目的】筛选高效的foxp3RNA干扰的靶点用于阻断CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制功能。【方法】使用oligoengine软件设计foxp3基因shRNA序列,化学合成法合成4条shRNA序列,构建含foxp3的靶序列的慢病毒载体;构建出表达FLAG融合蛋白和目的基因的工具细胞293T细胞用于筛选RNA干扰的有效靶点。【结果】成功包装了4条foxp3基因靶序列相应的慢病毒颗粒;成功构建了表达融合蛋白和目的基因的293T工具细胞;在工具细胞上筛选出了2条RNAi效率分别为91.3%和95.6%的有效靶点。【结论】使用FLAG融合蛋白和慢病毒载体能够筛选出Foxp3基因的RNAi最佳靶点。

一种高效稳定的磷酸钙转染293T细胞方法的建立及评价

目的:探讨2种磷酸钙转染法转染293T细胞的效果,建立一种实现高效稳定磷酸钙转染293T细胞的方法。方法:荧光显微镜观察采用2种磷酸钙转染方法(传统磷酸钙转染法和改良磷酸钙转染法)转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞的转染效率。采用Real-time PCR法和Western blotting法分别检测2种磷酸钙转染方法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞后,肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6) mRNA和flag蛋白表达水平。结果:荧光显微镜下观察,与传统磷酸钙转染法比较,改良磷酸钙转染法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞24 和48 h后的转染效率明显升高( P <0.01);Real-time PCR法和Western blotting法检测,与传统转染方法比较,磷酸钙转染改良法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞24 和48 h后,TRAF6 mRNA 和flag蛋白表达水平均明显升高( P <0.01)。结论:本研究建立的改良磷酸钙转染方法是一种高效、稳定的DNA转染方法。