微小RNA-103a-3p通过肿瘤蛋白53调控凋亡抑制剂1/P53对骨质疏松症的影响

目的探讨微小RNA(miR)-103a-3p调控细胞肿瘤蛋白53调控凋亡抑制剂1(TRIAP1)对成骨细胞分化以及去卵巢小鼠骨量的影响。方法MC3T3-E1细胞分为正常对照(NC)组、miR-103a-3p-NC组、miR-103a-3p模拟(mimc)组、miR-103a-3p mimic+TRIAP1-NC组、miR-103a-3p mimic+TRIAP1 mimic组。Real-time PCR检测细胞miR-103a-3p、TRIAP1、P53的mRNA表达,MTT法和流式细胞术检测细胞增殖及凋亡,免疫荧光染色和茜红素染色检测细胞骨架F-actin表达和矿化情况,ELISA检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性。24只雌性小鼠设为sham组、骨质疏松症(OP)组、miR-103a-3p antagonist-NC组和miR-103a-3p antagonist组,每组6只摘取双侧卵巢制备OP模型,sham组仅分离卵巢组织周围脂肪。测定骨组织miR-103a-3p、TRIAP1、P53、ALP、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)的mRNA表达,microCT测定骨密度(BMD)、骨矿物质含量(BMC),HE染色观察骨组织病理改变。结果细胞转染miR-103a-3p mimic后,miR-103a-3p及P53表达升高、TRIAP1表达降低,细胞增殖降低、凋亡增加,F-actin表达减弱,钙结节数量减少,ALP活性降低(P<0.01);而在增加转染TRIAP1 mimic后,以上miR-103a-3p mimics导致的结果均得到显著逆转(P<0.01)。OP组小鼠骨组织miR-103a-3p、P53表达升高,TRIAP1、ALP、OCN、OPN基因表达降低,BMD、BMC降低,骨组织结构破坏(P<0.05);miR-103a-3p antagonist组小鼠骨组织miR-103a-3p及P53表达降低,TRIAP1、ALP、OCN、OPN基因表达升高,BMD、BMC升高,骨组织结构改善(P<0.05)。结论MiR-103a-3p可介导TRIAP1/P53抑制成骨细胞增殖及矿化,而miR-103a-3p拮抗治疗可减少OP小鼠骨量丢失。

堆型艾美耳球虫裂殖子外分泌蛋白对细胞凋亡的抑制作用

为了研究堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)裂殖子的外分泌蛋白对马-达氏牛肾(MDBK)细胞凋亡的抑制作用,本试验建立Transwell小室间接共培养体系,即将E.acervulina裂殖子与MDBK细胞共培养,采用流式细胞术分别检测共培养1.5、3和6 h MDBK细胞的凋亡情况,利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)对共培养6 h后的细胞上清液中的成分进行鉴定。结果显示,1.5、3和6 h共培养组MDBK细胞的总细胞凋亡率分别为(5.92±0.19)%、(8.13±0.32)%和(11.57±0.37)%,与对照组相比,总细胞凋亡率均极显著降低(P<0.01)。LC-MS/MS分析共鉴定到65个E.acervulina的外分泌蛋白,包括热休克蛋白、微线蛋白、能量代谢酶分子、蛋白磷酸酶分子和未知功能蛋白等。结果表明,E.acervulina裂殖子外分泌蛋白可抑制MDBK细胞凋亡,具体哪种蛋白在抑制细胞凋亡中发挥作用有待后续进一步研究。

凋亡抑制蛋白FLIP在脑星形细胞瘤中的表达和意义

目的 :检测脑星形细胞瘤中凋亡抑制蛋白FLIP的表达 ,并进而揭示其在肿瘤发生发展中的意义 .方法 :采用免疫组织化学技术和蛋白印迹技术 ,分析 4 8例星形细胞瘤 (其中Ⅰ级 1 4例 ,Ⅱ级 1 8例 ,Ⅲ级 1 0例 ,Ⅳ级 6例 )标本和 1 0例颅脑损伤标本中FLIP蛋白的表达 ,并对不同级别星形细胞瘤中该蛋白的表达进行统计学比较 .结果 :低级别星形细胞瘤与高级别星形细胞瘤中FLIP的表达水平有显著差异(P <0 .0 1 ) .结论 :FLIP的表达水平与星形细胞瘤恶性程度密切相关 ,这可能为阐明星形细胞瘤恶性进展的分子机制 。

血清亲环素A联合凋亡抑制蛋白水平对重型颅脑损伤患者预后的预测价值

目的研究血清亲环素A(CypA)联合凋亡抑制蛋白(Arc)水平对重型颅脑损伤(STBI)患者预后的预测价值。方法选取于2018年3月-2020年12月收治的STBI患者140例。根据GCS评分结果将患者分为预后不良组(110例)和预后良好组(30例)。收集患者的基本资料,包括性别、年龄、身高、体质指数(BMI)、生命体征、治伤原因、院内心肺复苏、插管比例等,收集患者24 h内首次临床检查结果。比较两组患者各参数的差异并进行单因素和多因素分析,评估影响因素对STBI患者预后的预测价值。结果两组患者收缩压、舒张压、院内插管、院内心肺复苏、凝血酶时间、血浆凝血酶原时间、CypA和Arc等组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。多因素分析结果显示,CypA和Arc是STBI患者预后不良的危险因素(P<0.05)。采用Spearman分析法对CypA和Arc与预后的相关性进行分析,结果显示,CypA和Arc与预后均呈正相关(r=0.512,P<0.001;r=0.602,P<0.001)。采用受试者工作特征曲线(ROC)评估CypA和Arc表达水平对STBI患者预后评估的效能,结果显示,STBI患者CypA表达水平的曲线下面积(AUC)为0.858(95%CI:0.810~0.905,P<0.001),Arc表达水平的AUC为0.839(95%CI:0.785~0.894,P<0.001),联合预测的AUC为0.971(95%CI:0.949~0.992,P<0.001)。结论血清CypA联合Arc水平对STBI患者预后有一定的预测价值。

凋亡抑制蛋白FLIP在甲状腺乳头状癌中的表达及意义

目的:探讨FLIP在甲状腺乳头状癌中的表达及其对于良、恶性甲状腺肿瘤的鉴别价值。方法:采用SP免疫组织化学法对64例甲状腺乳头状癌手术切除标本进行FLIP的检测。结果:FLIP在甲状腺乳头状癌中的表达阳性率67.1%,明显高于甲状腺良性病变组织15%;良、恶性病变之间比较,差异有高度显著性(P<0.01)甲状腺乳头状癌各临床指标之间比较,差异无显著性意义(P>0.05)。结论:FLIP可有效地区别良、恶性甲状腺病变,可作为甲状腺乳头状癌鉴别诊断标志。

X-染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1通过自噬途径调控Caspase 1介导的胃肠道间质瘤细胞焦亡

目的:探究X-染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1(XAF1)对人胃肠道间质瘤(GIST)细胞中半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase 1)介导的细胞焦亡的影响及机制。方法:实时荧光定量PCR和Western blot检测人正常胃黏膜上皮细胞系(RGM-1)和GIST细胞系(GIST-T1、GIST-430、GIST-882)中XAF1的表达水平;采用脂质体介导转染法将pcDNA3.1-XAF1重组质粒染进GIST-882细胞,以构建高表达XAF1的GIST-882细胞。GIST-882细胞分为对照组、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1空载体质粒)、pcDNA3.1-XAF1组(转染pcDNA3.1-XAF1重组质粒)、pcDNA3.1-XAF1+Rap组(转染pcDNA3.1-XAF1重组质粒并给予自噬激活剂雷帕霉素处理),免疫荧光染色检测各组细胞内微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达情况,Western blot检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与Beclin1蛋白表达水平,ELISA法检测各组细胞上清中白细胞介素,IL-1β、IL-18含量,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测各组细胞LDH释放率,Western blot检测各组细胞中Caspase-1及其活化形式cleaved-Caspase-1、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、消皮素D(GSDMD)蛋白表达水平。结果:与RGM-1细胞比较,GIST-T1、GIST-430、GIST-882细胞中XAF1 mRNA和蛋白相对表达量显著减少(P<0.05);细胞转染后,pcDNA3.1-XAF1组GIST-882细胞中XAF1 mRNA和蛋白相对表达量均显著高于pcDNA3.1组、对照组(P<0.05)。与对照组比较,pcDNA3.1-XAF1组GIST-882细胞内LC3荧光强度明显减弱,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白相对表达量显著减少(P<0.05),细胞上清液IL-1β、IL-18含量及LDH释放率显著升高(P<0.05),Caspase-1、cleaved-Caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白相对表达量也显著增加(P<0.05);与pcDNA3.1-XAF1组比较,pcDNA3.1-XAF1+Rap组GIST-882细胞内LC3荧光强度明显增强,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白相对表达量显著增加(P<0.05),同时,细胞上清液IL-1β、IL-18含量及LDH释放率显著下降(P<0.05),Caspase-1、cleaved-Caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白相对表达量也显著减少(P<0.05)。结论:XAF1在GIST细胞中表达下降,提高XAF1表达能通过抑制自噬从而促进Caspase 1介导的GIST细胞焦亡,发挥抗肿瘤作用。

一种新的凋亡抑制蛋白:FLIP

FLIP(FLICE inhibitory protein)是近年来发现的一类含有死亡效应结构域 (DED)的凋亡抑制蛋白 ,在病毒、真核生物、哺乳动物等许多物种中广泛存在。FLIP在结构与序列上与Caspase 8有很多相似之处 ,且能抑制Caspase 8结合到死亡诱导信号复合物 (DISC)上 ,从而阻断Fas介导的凋亡信号转导。因此认为FLIP与炎症、肿瘤及自身免疫性疾病的发生、发展密切相关。对FLIP的进一步研究将有助于深化对这些疾病的认识 。

蛋白酶体抑制剂MG132对人胃癌细胞MGC-803自噬、凋亡和迁移的影响

目的探究蛋白酶体抑制剂MG132对人胃癌细胞MGC-803自噬、凋亡和迁移的影响,分析其对上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达的影响。方法应用0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL和2.00μg/mL的MG132处理MGC-803细胞后,用激光共聚焦显微镜检测自噬小体数目的变化以分析其对自噬的影响,通过流式细胞仪检测细胞凋亡比例的变化,并通过Transwell细胞迁移实验检测MG132对细胞迁移能力的影响。通过免疫印迹实验检测细胞凋亡相关蛋白和EMT相关蛋白表达的变化。结果在MGC-803细胞中,与空白对照组比较,随着MG132药物浓度的升高,MG132对MGC-803细胞具有毒性作用;1.00μg/mL的MG132明显增加MGC-803细胞的自噬小体数目(1.00μg/mL:t=9.459,P=0.011);随着MG132浓度的升高,细胞凋亡比例明显增多(0.25μg/mL:t=5.149,P=0.036;0.50μg/mL:t=7.342,P=0.018;1.00μg/mL:t=15.340,P=0.004);Western blotting发现MG132处理MGC-803细胞后,随着药物浓度的增加,BAX表达明显增加(0.25μg/mL:t=4.646,P=0.043;0.50μg/mL:t=4.610,P=0.044;1.00μg/mL:t=10.760,P=0.009),Bcl-2表达明显降低(0.25μg/mL:t=22.850,P=0.002;0.50μg/mL:t=26.780,P=0.001;1.00μg/mL:t=29.890,P=0.001);随着MG132浓度的升高,迁移细胞数目明显减少(0.25μg/mL:t=16.730,P=0.004;0.50μg/mL:t=27.340,P=0.001;1.00μg/mL:t=32.800,P<0.001);0.50μg/mL浓度MG132改变EMT相关蛋白表达水平,E-钙黏蛋白表达明显升高(0.50μg/mL:t=4.405,P=0.048;1.00μg/mL:t=12.170,P=0.007),N-钙黏蛋白(0.50μg/mL:t=5.163,P=0.036;1.00μg/mL:t=6.811,P=0.021)和波形蛋白(0.50μg/mL:t=5.628,P=0.030;1.00μg/mL:t=12.670,P=0.006)表达明显降低。结论MG132处理人胃癌细胞MGC-803能促进细胞自噬和凋亡,并通过EMT进程抑制细胞迁移。

凋亡抑制蛋白c-FLIP(L)对肺癌细胞增殖迁移的影响

目的:近来凋亡抑制蛋白c-FLIP(L)作为新的抗肿瘤治疗靶点受到关注,为了探讨c-FLIP(L)在肺癌细胞迁移中的作用,我们建立了c-FLIP(L)高表达稳定细胞株,以比较c-FLIP(L)在肺癌细胞株中表达水平与其细胞迁移能力的关系。方法:采用非小细胞肺癌A549细胞株进行转染c-FLIP(L)真核表达质粒,通过G418筛选出多株c-FLIP(L)高表达单克隆,以此为平台研究c-FLIP(L)在肿瘤细胞迁移过程中的作用。通过实时荧光定量QPCR及Western Blot检测稳定株中c-FLIP(L)表达水平;划痕实验及Transwell法检测cFLIP(L)高表达对肺癌细胞迁移的影响,并通过荧光骨架蛋白染色观察细胞形态的改变。结果:QPCR和Western Blot显示A549稳定细胞株中c-FLIP(L)均为高表达;Wound healing和Transwell实验表明c-FLIP(L)高表达肺癌细胞迁移能力明显上升,并初步探索了c-FLIP(L)表达对细胞骨架的影响。结论:凋亡抑制蛋白c-FLIP(L)的高表达能促进肺癌A549细胞的迁移。

凋亡抑制蛋白livin在人胃癌中的表达以及和survivin表达的关系

目的:探讨胃癌组织中凋亡抑制蛋白livin表达情况及其与各临床病理因素的关系,以及和凋亡抑制蛋白survivin表达的相关性。方法:采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测胃癌组织中livinα、livinβ和survivin的mRNA的表达,并用westernblot分析livin和survivin蛋白的表达。结果:40例胃癌组织中livin表达阳性率为47.5%、survivin为60%,而在正常和癌旁组未检出阳性结果;livin的表达与组织分化和淋巴结转移有关,组织分化差,淋巴结转移者livin表达率高(P<0.05);24例survivin阳性样本中有14例livin呈阳性。结论:livin在胃癌组织中表达增高,可作为胃癌的分子标志物,可能成为胃癌治疗的新分子靶点,livin表达和survivin表达在本实验中结果显示没有相关性(P>0.05)。

一种新的凋亡抑制蛋白Livin在非小细胞肺癌组织中的表达

目的 探讨一种新的凋亡抑制蛋白 (inhibitorofapoptosisprotein ,IAP)Livin两种异构体Livinα和Livinβ在非小细胞肺癌 (NSCLC)组织中的表达及其与NSCLC组织类型、放化治疗的关系。方法 采用逆转录多聚酶链式反应 (RT PCR)检测NSCLC组织中Livinα和LivinβmRNA的表达 ,并用westernblot分析Livin蛋白的表达。 结果 4 8例NSCLC组织中Livin表达阳性率为 2 2 .9% ,其表达与NSCLC组织学类型相关 ,腺癌中Livin表达阳性率达 4 5 .5 % ,明显高于鳞癌和大细胞癌 (P <0 .0 1 ) ,而癌旁组织和良性疾病肺组织未检出阳性结果 ;Livin表达还与肿瘤治疗相关 ,放化治疗可明显诱导Livin表达 (P <0 .0 1 )。结论 Livin异构体在非小细胞肺癌组织中表达 ,作为肺腺癌的分子标志物 。

地塞米松对脑缺氧缺血新生大鼠细胞凋亡抑制蛋白1 mRNA及Caspase-3活性的影响

目的探讨新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后细胞凋亡抑制蛋白1(cIAP1)基因表达、Caspase-3活性的变化及地塞米松(DEX)对其影响,阐明DEX预处理对HIBD神经保护的可能机制。方法7日龄SD大鼠24只,随机分成DEX组、9g/L盐水组(NS组)、HIBD组、健康对照组。DEX、NS、HIBD组大鼠采用Rice方法制备HIBD模型。DEX和NS组在缺氧缺血前12h腹腔内分别注射DEX、等量9g/L盐水。取HIBD动物模型实验侧大脑半球,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测cIAP1基因表达,比色法测定Caspase-3活性。结果与健康对照组比较,HIBD组大鼠cIAP1基因表达明显下降(P<0.01),Caspase-3活性明显上升(P<0.01)。与HIBD组比较,DEX组cIAP1基因表达明显上升,而Caspase-3活性明显下降。结论脑缺氧缺血可导致cIAP1基因表达下调,Caspase-3活性升高。DEX能通过上调cIAP1基因表达,抑制Caspase-3活性,抑制细胞凋亡,起到神经保护作用。

消化道肿瘤组织中P-gp、凋亡抑制蛋白表达与体外化疗药敏性的关系及其意义

背景与目的:P-糖蛋白(P-gp)介导的经典耐药途径和细胞凋亡抑制是肿瘤多药耐药(MDR)研究最多的两种机制,肿瘤细胞多种MDR相关基因/蛋白共同表达、相互作用而出现多态性耐药。本研究通过分析肿瘤P-gp和凋亡抑制蛋白p53、Survivin、bcl-2表达与化疗药敏性的关系,探讨消化道肿瘤组织MDR相关因子表达能否反映肿瘤的化疗耐药性。方法:84例胃癌、大肠癌标本进行MTT法体外化疗药物敏感性实验,免疫组化染色检测组织中P-gp、p53、Survivin、bcl-2的表达,分析4种多药耐药相关因子表达与9种药物对肿瘤细胞抑制率的关系。结果:肿瘤组织中P-gp、p53、Survivin、bcl-2表达率分别为96.4%、64.3%、89.3%、60.7%;P-gp与bcl-2表达、Survivin与bcl-2表达具有正相关性(r=0.5072,r=0.3027,P<0.05)。在肿瘤组织耐药因子表达程度与药物对肿瘤细胞抑制率的关系中,P-gp强表达组PTX、OXA、DDP对肿瘤细胞的抑制率明显低于弱表达组(P<0.05);p53强表达与PTX、DDP对肿瘤细胞的抑制率明显降低有关(P<0.05);Survivin强表达时,VCR、DDP对肿瘤细胞的抑制率明显降低(P<0.05),但OXA对肿瘤细胞的抑制率明显增加(P<0.01);bcl-2强表达时,5-FU、VCR、EADM、OXA对肿瘤细胞的抑制率明显低于弱表达组(P<0.05)。结论:消化道肿瘤P-gp、p53、Survivin、bcl-2表达程度仅与其对部分化疗药物的耐药性有关,评价消化道肿瘤组织某种耐药因子表达与化疗药物耐药性的关系必须考虑多种因素调节的影响。

蛋白酶体抑制剂MG132诱导HL-60细胞凋亡前G_2/M期阻滞及机制

背景和目的:蛋白酶体(proteasome)抑制剂能够诱导多种肿瘤细胞凋亡,是一种潜在的有应用前景的抗肿瘤剂。本研究旨在探讨蛋白酶体抑制剂MG132(Z-Leu-Leu-Leu-CHO)诱导白血病细胞HL-60凋亡和G2/M期阻滞的机制。方法:采用荧光显微镜观察、流式细胞术和免疫印迹研究测定MG132诱导HL-60细胞凋亡和周期阻滞及机制。结果:2μmol/L的MG132能够有效地诱导HL-60细胞凋亡,用药后24h就显现有细胞凋亡;在MG132诱导HL-60细胞凋亡出现之前有一个明显的G2/M期阻滞,加MG132后12h时G2/M期时相百分比为63.42±2.02;24h时加MG132组细胞凋亡为16.67±1.48,与对照组G2/M期时相百分比为7.29±3.01及细胞凋亡为0相比,两者之间有显著性差别(P<0.01);咖啡因CAF能够减少MG132诱导HL-60细胞出现的G2/M期阻滞,同时也减少凋亡细胞的比例;细胞周期检查点的负调控因子p21waf/cip1蛋白在加MG132处理后3h有明显的表达,但并未能检测到p53和p27蛋白。结论:MG132诱导HL-60细胞凋亡之前有一个明显的G2/M期阻滞,p21蛋白表达明显上调提示:是p21waf/cip1而不是p53或其同源蛋白参与了其中的调控。

针康法对脑缺血大鼠缺血半暗区细胞凋亡及X连锁凋亡抑制蛋白和cleaved-caspase-9蛋白表达的影响

目的观察针康法对脑缺血大鼠缺血半暗区细胞凋亡及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)和cleaved-caspase-9蛋白表达的影响。方法选取180只雄性Sprague-Dawley大鼠,通过随机数字表法随机分为假手术组、模型组、针刺组、康复组和针康组。每组再分为3 d、7 d和14 d三个亚组(n=12)。采用改良Longa线栓法进行造模,假手术组和模型组不予治疗,针刺组进行头穴丛刺治疗,康复组进行跑台康复训练,针康组进行针康法治疗。术后各时间点对大鼠进行改良神经功能缺损评分(mNSS)后取材,采用TUNEL染色观察大鼠脑缺血半暗区细胞凋亡率,Western blotting检测脑缺血半暗区XIAP和cleaved-caspase-9蛋白表达。结果术后各时间点,与模型组比较,各治疗组mNSS评分均降低(P<0.05),细胞凋亡率均降低(P<0.05),XIAP蛋白表达上调(P<0.05),cleaved-caspase-9蛋白表达下调(P<0.05);与针刺组、康复组比较,针康组细胞凋亡率进一步降低(P<0.05),XIAP蛋白表达进一步上调(P<0.05)。术后7 d、14 d,针康组mNSS评分进一步降低(P<0.05),针康组cleaved-caspase-9蛋白表达进一步下调(P<0.05)。结论针康法能降低脑缺血大鼠神经功能缺损,优于单独的头穴丛刺和康复训练,其机制可能与促进XIAP蛋白表达,抑制caspase-9蛋白活化,从而减少细胞凋亡有关。

凋亡抑制蛋白livin在良性及恶性子宫内膜组织中的表达

目的:探讨livin蛋白在良性及恶性子宫内膜组织中的表达情况。方法:选取子宫内膜腺癌组织44例,子宫内膜不典型增生组织11例,子宫内膜单纯性增生组织9例、增生期内膜10例、分泌期内膜8例,利用免疫组化S-P法染色及显微图像分析系统检测其中livin蛋白的表达。结果:livin在子宫内膜癌中的表达强度明显高于子宫内膜不典型增生及良性子宫内膜(P<0.05),livin的表达在子宫内膜癌不同组织学分级中有显著性差异(P<0.05),在不同分期中无明显差异,且与淋巴转移情况无关。结论:livin可能与肿瘤的的分化有关,可作为反映子宫内膜癌生物学行为的指标,有望成为子宫内膜癌的肿瘤标记物。

抑制X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)和Survivin表达对胰腺癌Panc-1细胞增殖及化疗敏感性的影响

目的:探讨同时抑制X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)和Sur-vivin表达,对胰腺癌Panc-1细胞增殖及吉西他滨(Gem)化疗敏感性的影响,并与单独抑制XIAP或Survivin表达的策略进行对比。方法:运用前期实验构建的XIAP-shRNA慢病毒(LV-X)和Survivin-shRNA慢病毒(LV-S),分别建立XIAP和/或Survivin表达稳定抑制的胰腺癌Panc-1细胞株,即Panc-1-X、Panc-1-S和Panc-1-XS。运用Real-timePCR和半定量Western blot分别检测XIAP和Survivin的mRNA和蛋白的表达情况,以细胞计数法及克隆形成实验检测细胞增殖能力,Caspase-3/7试剂盒及流式细胞仪检测细胞凋亡,MTT法检测细胞对Gem的化疗敏感性。结果:成功建立了XIAP和/或Survivin表达稳定抑制的胰腺癌细胞株Panc-1。XIAP和Survivin同时稳定抑制后,Panc-1的增殖能力显著受到抑制,Panc-1-XS组的克隆形成率为10.12%±1.33%,显著低于对照组Panc-1-XncSnc组(96.61%±7.89%)和Panc-1组(100.28%±8.97%,P<0.05)。用0.5 mg/L Gem处理24 h后,Panc-1-XS组的Caspase-3/7相对活性明显升高至15.02±0.57,显著高于Panc-1组与Panc-1-XncSnc组(分别为8.87±0.19和9.05±0.23,P<0.05);Panc-1-XS组的细胞凋亡率为24.09%±2.75%,显著高于对照组Panc-1-XncSnc及Panc-1组(分别为12.09%±1.97%和12.06%±1.22%,P<0.05)。Panc-1-XS组的IC50值为(0.47±0.04)mg/L,显著低于对照组Panc-1-XncSnc的(2.18±0.13)mg/L及Panc-1组的(2.13±0.18)mg/L(P<0.05),对Gem的化疗敏感性显著增强。进一步检测显示,Panc-1-XS组的IC50值为(0.47±0.04)mg/L,均显著低于Panc-1-X组的(0.76±0.07)mg/L和Panc-1-S组的(0.87±0.09)mg/L(P<0.05)。结论:同时稳定抑制胰腺癌细胞株Panc-1中XIAP和Survivin的表达,能显著抑制Panc-1细胞增殖能力,增强其Gem化疗敏感性,并明显优于XIAP或Survivin表达单独抑制的策略。

大鼠缺氧缺血后海马神经元凋亡及凋亡抑制蛋白XIAP表达的变化

目的探讨新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后海马CA1区神经元凋亡及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达的变化规律。方法选择48例新生Wistar大鼠为HIBD组,并选择12只新生大鼠分为假手术组(n=6)和正常对照组(n=6)。HIBD制模后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d、14 d处死取材,每次处死6只,采用流式细胞技术检测3组大鼠海马神经元的凋亡率,并应用免疫组织化学染色方法检测各组海马CA1区XIAP的表达变化情况。结果与假手术组相比,HIBD组缺氧缺血后3 h海马神经元凋亡率即开始升高,但差异无统计学意义(P>0.05);于缺氧缺血后12 h凋亡率显著升高(P<0.05),48 h时达高峰,72 h时开始下降,7 d时明显低于高峰水平(P<0.05),而与假手术组无显著差异,14 d时基本恢复至假手术组水平。正常对照组和假手术组海马CA1区有极少量XIAP阳性表达细胞。HIBD组于缺氧缺血3 h时XIAP阳性表达显著升高(P<0.05),之后逐渐升高,在48 h时达到高峰,72 h时开始逐渐下降,7 d时已明显低于高峰水平(P<0.05),但仍明显高于正常对照组和假手术组水平,在14 d时略高于正常对照组和假手术组,但差异无统计学意义(P>0.05)。XIAP蛋白表达与HIBD后各时间点阳性凋亡细胞出现呈负相关(r=-0.564,P<0.05)。结论 XIAP蛋白的过度表达在脑缺氧缺血后细胞凋亡的调控过程中起着重要作用,对HIBD损伤的脑神经细胞具有保护作用。

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL-60细胞的促凋亡作用

为了研究基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂诱导HL-60细胞凋亡的作用并探讨其抗癌作用机理,用不同浓度的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂体外作用于HL-60细胞,采用MTT比色法检测其对HL-60细胞的抑制率,应用光学显微镜观察细胞核的形态学变化,用DNA凝胶电泳法检测HL-60细胞的凋亡,用流式细胞术检测该抑制剂作用于HL-60细胞后引起的凋亡现象。结果表明:重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用,且随着蛋白质浓度的增加对HL-60细胞生长抑制愈加明显,而对正常人外周血单个核细胞(PBMNC)无作用;荧光显微镜下观察发现经该蛋白作用后HL-60细胞核的形态呈现凋亡特征;流式细胞术分析表明,HL-60细胞经100μg/ml重组荞麦胰蛋白酶抑制剂作用后,凋亡率达到52%;琼脂糖凝胶电泳显示细胞DNA呈梯状降解。结论:重组荞麦胰蛋白酶抑制剂在体外能够明显抑制HL-60细胞的增长,并诱导细胞凋亡,这为重组荞麦胰蛋白酶抑制剂应用于急性髓细胞性白血病的治疗提供依据,也为重组基因工程植物蛋白药物的临床应用提供新思路。

凋亡抑制蛋白Livin两种异构体真核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建凋亡抑制蛋白Livin两种异构体(Livinα和β)真核细胞表达载体pcDNA3.1-Livinα和pcDNA3.1-Livinβ。方法利用分子克隆技术,首先设计合成扩增Livin基因异构体全长cDNA序列的特异性PCR引物,以肺腺癌SPC-A1细胞总RNA为模板,RT-PCR获得Livin基因异构体全长cDNA序列,TA克隆将Livin全长cDNA序列克隆到T载体上,用限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ双酶切取所需目的片段,然后将该片段插入真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点,最后对产生的重组子进行双酶切、PCR鉴定,并经过测序证实后,构建成为Livin基因异构体表达载体(pcDNA3.1-Livin)。电穿孔法获得稳定表达Livinα和β的A549细胞克隆,Westernblot验证Livin蛋白在转染细胞中的表达情况。结果成功获得Livinα和Livinβ全长cDNA序列,并克隆到真核表达载体pcDNA3.1上;基因转染后,阳性细胞分别表达Livinα和β。结论Livin基因两种异构体真核表达载体的构建及在细胞中的表达鉴定,为进一步研究Livin异构体功能及在肺癌细胞中的抗凋亡效应奠定了基础。