絮凝基因(FLO1G)的序列测定及分析

The sequence of the flocculation gene (FLO1G) was determined. The result of sequcencing showed that:the cloned gene contains a large open reading frame (ORF) of 3936 bp and encodes for a protein of 1312 amino acid. According to the result of homologous analysis, the cloned gene is homologous to FLO1 but with 675 bp deletion in the ORF region. The missing part belongs to one of the four repeated sequence family of FLO1. Since the cloned DNA fragment can trigger strong flocculence to non-flocculent strain S.cerevisiae YS58, we concluded that the missing part is not the crutical part for the flocculent ability of the gene.

Lg-Flo1蛋白N端的诱导表达及活性研究

研究了Lg-Flo1蛋白N端的诱导表达条件及与甘露糖的结合活性。将构建的巴氏酵母Lg-FLO1基因N端序列的重组表达载体pETFL1进行双酶切验证,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过菌落PCR鉴定阳性转化子,并进行诱导表达,利用SDS-PAGE检测不同诱导条件对目的蛋白N-Lg-Flo1表达的影响,并对目的蛋白进行变性溶解、纯化、复性及活性测定。结果表明,酶切证实重组表达载体含有N-Lg-FLO1基因片段;在LB培养基中的表达量高于TB培养基;和IPTG相比,乳糖诱导同样可以表达含量较高的目的蛋白且成本较低。以乳糖作为诱导剂,终质量浓度为0.2g/L,诱导温度37℃,诱导6h,目的蛋白的表达量均高于30%;荧光光谱分析表明,复性后的N-Lg-Flo1蛋白具有与甘露糖结合的活性。该研究为大规模生产絮凝蛋白并以此为原料制备糖的特异性吸附剂奠定了基础。

利用Flo1p锚定蛋白在酿酒酵母表面展示三种纤维素酶的纤维素乙醇发酵

为了简化纤维素乙醇生产工艺,实现纤维素利用与乙醇发酵的同步进行,通过酵母细胞表面展示技术,以酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae Y5为受体,通过絮凝素(Flo1p)锚定方式,将来自丝状真菌里氏木霉Trichoderma reesei的内切葡聚糖酶Ⅱ(EGII)、纤维二糖水解酶Ⅱ(CBHII)以及来自棘孢曲霉Aspergillus aculeatus的β-葡糖苷酶Ⅰ(BGLI)展示在细胞表面,构建同时表达3种纤维素酶的酵母菌群系统。经过免疫荧光验证展示酶的细胞蛋白定位,酶活测定,乙醇发酵性能验证,结果表明:展示表达的3种纤维素酶具有良好的稳定性和功能活性;在EGII、CBHII和BGLI协同作用下重组酵母菌株能够水解溶胀磷酸纤维素(Phosphoric acid swollen cellulose,简称PASC)并产生乙醇,乙醇浓度达到最大值0.77 g/L,乙醇产量为0.35 g/g,相当于理论值的68.6%。本研究成功构建了利用Flo1p作为锚定蛋白的絮凝素展示系统,初步实现了纤维素利用与乙醇发酵的同步进行,为利用酿酒酵母表面展示技术固定并表达纤维素酶提供了一定的理论依据。

絮凝基因FLO1及FLO1c高表达提高工业酿酒酵母乙酸耐受性及发酵性能

乙酸是生物质乙醇发酵过程中酵母细胞面临的重要抑制剂之一,对细胞生长及发酵性能有强烈的抑制作用。增强酵母菌对乙酸胁迫的耐受性对提高乙醇产率具有重要意义。用分别带有完整絮凝基因FLO1及其重复序列单元C发生缺失的衍生基因FLO1c的重组表达质粒分别转化非絮凝型工业酿酒酵母CE6,获得絮凝型重组酵母菌株6-AF1和6-AF1c。同时以空载体p YCPGA1转化CE6的菌株CE6-V为对照菌株。与CE6-V相比,絮凝酵母明显提高了对乙酸胁迫的耐受性。在0.6%(V/V)乙酸胁迫下,6-AF1和6-AF1c的乙醇产率分别为对照菌株CE6-V的1.56倍和1.62倍;在1.0%(V/V)乙酸胁迫下,6-AF1和6-AF1c的乙醇产率分别为对照菌株CE6-V的1.21倍和1.78倍。可见絮凝能力改造能明显提高工业酿酒酵母的乙酸胁迫耐受性及发酵性能,而且FLO1内重复序列单元C缺失具有更加明显的效果。

FLO1基因靠近3'端重复序列对酵母菌絮凝蛋白功能的调控

【目的】研究絮凝基因FLO1中靠近3'端重复DNA序列缺失对絮凝蛋白Flo1功能的影响,为遗传稳定的最小絮凝功能基因的构建及酵母菌絮凝特性的可控改造提供理论依据。【方法】通过融合PCR的方法得到FLO1内靠近3'端重复DNA序列B、C和D全部缺失的衍生基因FLO1bcd,比较FLO1及FLO1bcd在非絮凝酵母细胞中表达后,菌株在不同条件下絮凝特性的差异。【结果】与表达完整絮凝基因FLO1的酵母菌株YSF1相比,FLO1内靠近3'端重复DNA序列全部缺失的酵母菌株YSF1bcd的絮凝强度仅略有降低,而且其絮凝特性对钙离子的依赖性、金属离子的敏感性及乙醇敏感性均没有明显变化,但对环境pH以及温度的变化表现出更广泛的适应性,受甘露糖抑制的敏感性也有所降低。【结论】FLO1中重复DNA序列B、C和D全部缺失与单独缺失C或D一样可以提高絮凝蛋白的构象和功能稳定性,使酵母细胞在极端酸碱环境下仍然表现出明显的絮凝特性;这些重复序列的完全缺失对其他絮凝特性没有明显影响。因此可以通过重复序列删减策略构建遗传稳定的最小絮凝功能基因,为絮凝特性在发酵工业及环境修复方面的可控应用奠定理论基础。

FLO1基因内重复序列对酿酒酵母絮凝能力及稳定性的影响

【目的】了解絮凝基因FLO1中重复DNA序列A对酵母菌絮凝能力及其遗传稳定性的影响,为构建遗传性能稳定、工业应用前景优良的最小絮凝功能基因奠定理论基础。【方法】通过融合PCR方法构建了FLO1中全部重复DNA序列A发生缺失的衍生基因FLO1a,以含有FLO1基因的大肠杆菌为筛选模型,通过连续传代培养及质粒快速分析获得FLO1内重复DNA序列A不同程度、不同位点缺失的系列衍生基因FLO1a1-FLO1a5。完整FLO1基因和上述衍生基因转化非絮凝型酵母YS58,得到重组菌株YSF1、YSF1a及YSF1a1-YSF1a5,分析了上述不同酵母菌株絮凝特性及其遗传稳定性。【结果】絮凝基因FLO1中重复DNA序列A完全缺失使酵母细胞完全失去絮凝能力,部分重复DNA序列A发生缺失导致絮凝能力降低,絮凝基因中重复DNA序列A的个数与细胞絮凝能力成正相关,但不是简单的比例关系。其中衍生基因FLO1a3含有的重复DNA序列A是FLO1基因的33.3%,但菌株YSF1a3的絮凝能力可达YSF1絮凝能力的71.4%。而且菌株YSF1a3的絮凝特性比菌株YSF1的絮凝特性具有更好的环境适应性和遗传稳定性。【结论】重复DNA序列A是絮凝基因中非常活跃的序列,是导致絮凝特性遗传不稳定的关键因素,该序列的部分缺失不但可以使酵母细胞呈现适度的絮凝能力,而且使絮凝特性具有更好的环境适应性和遗传稳定性。该研究为通过对絮凝基因内衔接重复序列的合理调控,促进酵母絮凝特性在发酵工业及其他生物化工过程和环境修复中的广泛应用提供了重要的理论依据和解决策略。

跨界融合子Fhhh降解PTA废水mnp基因转录研究

报道Fhhh的遗传稳定性 ,及其降解精对苯二甲酸 (PTA)废水过程中基因转录的研究结果 .聚合酶链式反应PCR的测定结果是 ,Fhhh同时含有mnp(来自黄孢原毛平革真菌 )、FL0 1(来自酿酒酵母真菌 )和 16SrDNA(来自土著细菌 )的 3个亲株的基因DNA片断 .表明Fhhh具有分子遗传稳定性 .反转录一扩增 (RT_PCR)的测定表明 ,Fhhh和黄孢原毛平革菌在降解PTA废水过程中 ,在Mn2 +、Cu2 +、Zn2 +、Se4 +4种金属元素优化水平的条件下 ,mnp基因均可转录 .研究结果为高效处理PTA废水 。

细胞絮凝及硫酸锌对酿酒酵母乙酸胁迫耐性的影响

酿酒酵母细胞絮凝和外源添加锌离子对其环境胁迫耐受性都具有促进作用,为了解细胞絮凝形态对锌促进乙醇发酵的影响,比较硫酸锌添加对絮凝酿酒酵母SP SC01及其絮凝基因失活突变体SPSC01 FLO1Δ在乙酸胁迫条件下乙醇发酵的影响.结果显示,与野生型絮凝酵母相比,添加锌可更明显改善SPSC01 FLO1Δ在乙酸中的生长和发酵,在10 g L^(-1)乙酸存在的情况下,SPSC01在70 h消耗100 g L^(-1)葡萄糖,锌离子添加后可使发酵终点提前10 h,而SPSC01FLO1Δ在锌离子添加后发酵时间为48 h,可将发酵时间显著缩短138 h.这些结果表明,锌在酿酒酵母细胞缺少絮凝保护的条件下更能有效发挥作用,同时甘油、琥珀酸的增加在絮凝基因敲除突变体中更加明显.本文研究结果可为进一步利用絮凝及锌响应调控基因提高酿酒酵母的环境胁迫耐受性,提高燃料乙醇的生产效率奠定基础.

衔接重复序列对酵母菌絮凝蛋白功能的调控作用

【目的】了解絮凝基因FLO1中重复DNA序列B和D对絮凝蛋白Flo1p功能的影响,为构建遗传稳定的最小絮凝功能基因奠定理论基础。【方法】通过PCR和融合PCR方法分别克隆到完整的絮凝基因FLO1、重复DNA序列B和D分别缺失的衍生基因FLO1b和FLO1d,分析这些基因在非絮凝酵母中表达对细胞絮凝特性的影响。【结果】与完整絮凝基因相比,重复DNA序列B和D分别缺失后对酵母细胞絮凝强度没有明显影响,但不同基因在酵母菌中表达产生的絮凝特性受环境因素,如甘露糖浓度和pH等的影响有明显差异。FLO1中重复DNA序列B和D缺失后,细胞絮凝特性受甘露糖抑制的敏感性降低;同时对环境pH的改变具有更广泛的适应性。【结论】重复DNA序列B和D对絮凝蛋白Flo1p结构和功能具有调控作用,二者缺失后,特别是D缺失后会使絮凝蛋白在极端酸碱环境下更稳定。