稳定表达人细胞色素P450氧化还原酶(POR)的Flp-In^(TM) CHO细胞系的建立

目的建立稳定表达人细胞色素P450氧化还原酶(POR)的Flp-In^(TM) CHO细胞系,为进一步建立稳定双表达人POR与人细胞色素P450(CYP)的细胞系奠定基础。方法构建POR重组慢病毒并感染Flp-In^(TM) CHO细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,挑选转染细胞进行嘌呤霉素筛选和单克隆培养,以获得稳定转染细胞株。利用丝裂霉素C(MMC)细胞毒实验、实时荧光定量PCR和Western blot法检测细胞POR的表达,获得稳定表达POR的Flp-In^(TM) CHO-POR细胞株。构建稳定双表达POR和CYP2C19的Flp-In^(TM) CHO-POR细胞(Flp-In^(TM) CHO-POR-2C19)和单表达CYP2C19的Flp-In^(TM) CHO细胞(Flp-In^(TM) CHO-2C19),并用环磷酰胺(CPA)测定CYP2C19酶活性。结果与感染阴性对照病毒的Flp-In^(TM) CHO细胞相比,感染POR重组慢病毒的Flp-In^(TM) CHO细胞MMC代谢活性升高,POR mRNA和蛋白的表达水平增加,说明获得了可稳定表达POR的Flp-In^(TM) CHO-POR细胞。与Flp-In^(TM) CHO细胞相比,Flp-In^(TM) CHO-2C19的CPA代谢活性无显著差异,而Flp-In^(TM) CHO-POR-2C19的CPA代谢活性增加且明显高于Flp-In^(TM) CHO-2C19细胞。结论成功建立了稳定表达POR且可进一步用于CYP转基因细胞构建的Flp-In^(TM) CHO-POR细胞系。

细胞色素P450 3A4基因C239S突变体稳定表达Flp-In^(TM)CHO细胞系的建立

目的构建稳定表达细胞色素P450家族3亚家族A成员4(CYP3A4)的C239S突变体(CYP3A4-C239S)的Flp-In^(TM)CHO细胞系。方法使用Lipofectamine2000转染试剂将pcDNA5/FRT-CYP3A4-C239S突变型重组质粒和pcDNA5/FRT-空质粒转染至Flp-In TM CHO细胞,潮霉素B(500 g/L)进行稳定筛选,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹(Western blot)检测细胞中CYP3A4-C239S的mRNA和蛋白表达,采用黄曲霉素B1(AFB1)细胞毒性实验检测细胞活性。结果与Flp-In^(TM)CHO-空质粒组相比,Flp-In^(TM)CHO-3A4-C239S组的CYP3A4-C239S mRNA和蛋白表达水平均显著增加(P<0.001),AFB1细胞毒性实验显示,CYP3A4-C239S细胞组对AFB1的毒性敏感度显著增加(P<0.001)。结论成功构建了稳定表达CYP3A4-C239S的Flp-In^(TM)CHO细胞系,且为后续研究CYP3A4突变对药物代谢的影响支撑基础。

FLP/FRT位点特异性重组系统在高等真核生物中的研究进展

来源于酵母2μm质粒的FLP/FRT位点特异性重组系统已经被广泛应用于拟南芥、水稻、小鼠、果蝇、线虫等高等真核模式生物,正逐渐成为转基因动植物研究领域进行基因操作的强有力工具。笔者综述了FLP/FRT系统的重组原理及其在高等真核生物中的应用,系统地概述了该系统在转基因植物、哺乳动物、昆虫以及其它相关高等真核模式生物中的研究现状,讨论了FLP/FRT系统在研究中存在的主要问题、应用前景和发展方向。

FLP滤波算法在光纤陀螺信号预处理中的应用

在简要地介绍FLP(前向线性预测)滤波技术的基础上,采用该方法对某型光纤陀螺信号进行FLP实时滤波,对滤波后的数据进行了功率谱密度和Allan方差分析,并把滤波效果与小波变换滤波和IIR数字滤波器的滤波效果进行了对比,得出了FLP滤波能有效的减少光纤陀螺的零偏不稳定性、角度随机游走误差和抑制高频噪声的结论。

FOLFOX4与FLP方案用于食管胃结合部癌和远端胃癌辅助化疗的比较

目的回顾分析FOLFOX 4方案与FLP方案在食管胃结合部癌和远端胃癌根治术后辅助化疗中的疗效和不良反应。方法 2007年3月至2009年10月,我科收治食管胃结合部癌及远端胃癌根治术后应用FOLFOX 4方案及FLP方案治疗的患者267例,其中食管胃结合部癌123例,远端胃癌144例,均经病理诊断证实。FOLFOX 4方案：奥沙利铂85mg/m2静滴,d1;氟尿嘧啶400mg/m2静推,600mg/m2持续静滴22h,d1、d2;亚叶酸钙200mg静滴,d1、d2;2周为1周期。FLP方案：顺铂30mg/m2静滴,d1~d3;氟尿嘧啶500mg/m2静滴4h,d1~d5;亚叶酸钙200mg静滴,d1~d5;3周为1周期。主要观察指标为无病生存期（DFS）、总生存期（OS）及不良反应,并对两组疗效和不良反应进行比较。结果食管胃结合部癌中,FOLFOX 4方案组及FLP方案组的中位DFS分别为35.9个月和16.8个月（P=0.008）,中位OS分别为41.3个月和25.6个月（P=0.013）。远端胃癌中,FOLFOX 4方案组及FLP方案组的中位DFS分别为35.8个月和31.8个月（P=0.925）,中位OS分别为46.6个月和43.5个月（P=0.720）。FOLFOX 4及FLP方案耐受性均良好,血液学不良反应无显著性差异,FOLFOX 4方案非血液学不良反应主要表现为外周神经毒性,FLP方案为消化道反应。结论在食管胃结合部癌辅助化疗中,与FLP方案比较,FOLFOX 4方案可延长患者的DFS和OS,且不良反应能够耐受,可开展进一步前瞻性研究;在远端胃癌辅助化疗中,未发现上述两方案的DFS或OS差异,不良反应能够耐受,均可作为根治术后辅助化疗方案。

FLO和FLP方案治疗晚期胃癌的临床观察

目的探讨FLO和FLP方案治疗晚期胃癌的疗效和毒副作用。方法将62例晚期胃癌患者随机分为A、B两组,分别用FLO方案（A组）和FLP方案（B组）化疗,每2周为1个周期,共8个周期,观察其疗效、骨髓毒性、呕吐副作用及外周神经毒性等。结果治疗有效率A组为41%,B组为17%（P〈0.01）;Ⅲ~Ⅳ度骨髓损害发生率A组为38%,B组为37%（P〉0.05）;Ⅲ~Ⅳ度呕吐发生率A组为9%,B组为30%（P〈0.01）;Ⅰ~Ⅱ度外周神经毒副作用发生率A组为72%,B组为7%（P〈0.01）,Ⅲ~Ⅳ度外周神经毒副作用发生率A组为3%,B组为0%（P〉0.05）。结论 FLO较FLP治疗晚期胃癌疗效更好,呕吐更轻,虽然外周神经毒副作用多,但症状轻。

低剂量羟基喜树碱联合低剂量FLP方案治疗晚期消化系肿瘤

目的:观察低剂量羟基喜树碱(HCPT)联合低剂量FLP方案治疗晚期消化系肿瘤的疗效和毒副作用。方法:37例晚期消化系肿瘤患者,予以HCPT5mg/d,连用12天,CF100mg/d,静滴2小时,5Fu300mg/d,持续静脉灌注(加入Baxter泵),连用14天,PDD8mg/d,静点2小时,第1～5天,第8～14天。结果:37例患者均可评价疗效,其中CR2例(5.4%),PR20例(54.1%),SD14例(37.8%),PD1例(2.7%),总有效率(CR+PR)为59.5%。主要毒副作用为消化道反应、静脉炎和轻度骨髓抑制。结论:应用低剂量HCPT联合低剂量FLP方案治疗晚期消化系肿瘤有效率高,毒性反应小,且能明显改善患者生活质量。

单子叶植物的FLP/frt位点特异性重组系统的构建

来自于啤酒酵母2μm质粒的FLP/frt位点特异性重组系统可用于转基因植物(细胞)筛选完成后去除选择标记基因.水稻肌动蛋白actin基因启动子和玉米泛素ubiquitin基因启动子可有效驱动单子叶植物中外源基因的转录.为培育去除选择标记基因的抗盐耐旱单子叶转基因植物,构建了适合于单子叶植物的FLP/frt位点特异性重组系统.该系统由含有FLP重组酶基因的植物表达载体pCAMBIA3300-Ubi-FLP-bar和含有frt位点的植物双抗(抗除草剂、抗盐耐旱)表达载体pCAMBIA1300-Ubi-TsPPasef-rt-alsf-rtm以及pCAMBIA1300-Actin1-AtNHX1f-rt-alsf-rtm组成.

DNA重组酶FLP原核表达与多步法纯化及其活性检测

DNA重组酶FLP存在于酵母2μ质粒上，能识别34bp的FRT位点，并根据2个FRT位点的相对方向完成位点间DNA序列的交换、重组、删除与逆转，在现代分子生物学理论研究与基因工程技术开发中具有广泛应用。构建了在原核大肠杆菌中高效表达FLP重组酶的表达载体pQE32-flpe并建立起相应的原核高效表达体系，在原核细菌大肠杆菌M15菌株中实现FLP酶蛋白的高效表达，同时建立了相应的纯化方法。纯化时先用硫酸铵沉淀法富集FLP酶蛋白，经透析脱盐后再用镍离子鳌合微柱（0．5—1．0mL）亲合层析梯度洗脱的方法获得纯化的FIJP酶蛋白。通过构建含有2个方向相同的FRT序列位点的质粒pUC18-FRT-gfp-FRT和含有1个FRT位点的表达载体pET30a-FRT，并分别以其为底物来检测FLP重组酶的删除、交换与重组功能的活性。结果表明，该方法不仅能有效表达FLP酶蛋白，并能行之有效地纯化FLP酶蛋白，以及检测纯化的FLP酶蛋白对DNA序列的删除、重组与交换功能。该方法简单易行并能获得有活性的FLP酶蛋白，为深入研究其机理以及研发相应的DNA重组技术提供重要参考。

含FLP“交换盒”结构的打靶载体构建及ES细胞打靶研究

利用小鼠HPRT基因组DNA片段和人工合成的含有FLP重组酶识别位点变异体FRT和F3RT序列的寡核苷酸 ,构建了针对小鼠HPRT基因位点的置换型打靶载体pSP HPRT F Neo F3。经过限制酶酶切及部分测序鉴定其结构正确后 ,将线性化了的打靶载体以电穿孔法导入ES细胞内 ,经G418和 6 -TG双药筛选和分子鉴定 ,得到了 2个在HPRT位点整合有FLP重组酶“交换盒”F Neo F3结构的双交换重组ES细胞克隆 ,为建立基于FLP重组酶介导的盒式交换的高效。

叶片衰老诱导FLP重组酶删除转基因烟草外源基因的研究

【目的】"Gene-deletor"系统可实现转基因植物中外源基因的清除。为了研究该系统在转基因烟草中对清除外源基因的作用并最终创制不含外源基因的烟草新种质。【方法】以含有"Gene-deletor"系统的转基因烟株为材料,分析外源筛合报告选融基因Bar::GUS、重组酶基因FLP在不同叶龄叶片中的表达水平,同时通过观察转基因烟草花粉中GUS蛋白的表达活性,分析外源基因GUS在花粉中的删除情况。【结果】(1)相同叶龄不同转基因烟株叶片均表现出GUS活性和对除草剂草铵膦抗性,且3个转基因烟草株系中GUS活性和对除草剂抗性都表现出随着叶龄增大而降低的特点。(2)Real-time PCR和RT-PCR结果进一步证明外源Bar::GUS基因表达水平随叶片发育成熟持续下降,而外源FLP基因的表达水平则出现先增后降的变化趋势,在测定后期两者的表达量均达到最低,(3)花粉GUS组织染色结果表明,"明,色结果降的变化趋势,特系统诱导各转基因植株中花粉外源基因清除效率不同,平均清除率分别78.3%,54.7%和75.2%。【结论】在转基因烟草中,叶片衰老特异表达基因SAG12基因启动子驱动"动启动子驱动达基因,平均清系统(LoxP/FRT)的表达不仅可引起转基因植株叶片中外源基因的特异性清除,还能诱导花粉中外源基因的删除,该技术可为进一步创制培育不含外源基因的烟草新种质提供参考。

FLP/FRT位点特异性重组系统在剔除植物筛选标记基因中的应用

作为标记基因剔除的重要手段之一的FLP/FRT位点特异性重组系统自发现以来,在植物基因工程研究领域尤其是标记基因的删除方面得到了广泛应用,已成为提高转基因植物安全性的有效方法.文章就FLP/FRT位点特异性重组系统的基本概况及其在植物基因工程中标记基因删除方面的应用进行综述,并讨论了其在实际应用中的利弊与在分子生物学研究中的应用前景.

小剂量FLP方案治疗晚期消化系肿瘤的胃肠道反应观察

以小剂量 FL P方案持续灌注治疗晚期消化系肿瘤 ,观察其胃肠道反应 ,与常规的以 5— FU为主的化疗方案相比较。结果表明小剂量 FL P方案组胃肠道反应低于常规化疗组 ,特别在重度胃肠道反应尤为明显 ,经统计差异有显著性 (P<0 .0 1)。提示小剂量 FL P方案胃肠道反应小 ,为晚期消化系肿瘤理想治疗方案。

FOLFOX4与FLP方案在治疗食管-胃结合部癌和远端胃癌中的临床疗效比较

对FOLFOX4与FLP方案在治疗食管-胃结合部癌和远端胃癌中的临床疗效进行比较分析。选取收治的食管-胃结合部癌和远端胃癌患者各40例,分别采用两种方案进行化疗。食管-胃结合部癌FOLFOX4方案组中位DFS和中位OS显著优于FLP组(P<0.05),远端胃癌FOLFOX4方案组中位DFS和中位OS与FLP组比较差异无显著性(P>0.05)。食管-胃结合部癌辅助化疗中,FOLFOX4方案在延长患者总生存期和无病生存期优于FLP方案,应首选FOLFOX4方案;远端胃癌辅助化疗中,FOLFOX4方案与FLP方案疗效比较无差异,均可作为辅助化疗方案。

番鸭cDNA-AFLP体系的建立

以番鸭脑垂体为材料,用Trizol法提取总RNA,用Superscipt II-RT合成第一链cDNA,RNase H和DNA Polymerase合成第二链cDNA,最后用EcoRⅠ/MseⅠ分步酶切cDNA各2 h,经T4连接酶合成双链cDNA,预扩增反应后产物稀释40倍进行选择性扩增反应.经1%琼脂糖电泳及6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果显示,番鸭脑垂体总RNA的提取及cDNA-AFLP预扩增和选择性扩增的效果良好.番鸭cDNA-AFLP反应体系的建立为番鸭就巢的分子机理研究奠定了基础.

基于Flp重组酶介导的盒式交换HPRT位点定点转基因研究

以电穿孔转染法将构建的交换质粒pF-HPRTF3和Flp表达载体pCMV-Flp共转染已在基因组HPRT位点整合有交换盒F-Neo-F3结构的ES细胞F18,经HAT筛选得到HAT抗性ES细胞克隆;G418敏感性试验和基因组Southern杂交表明,所分析的12个HAT抗性克隆中有3个克隆发生了预期的盒式交换重组,转基因定点整合的相对效率为25%。这一结果表明,Flp重组酶是可以在HPRT位点有效地介导盒式交换反应的,我们提出的利用Flp重组酶介导的盒式交换反应建立基于HPRT位点的转基因定点整合体系的策略是可行的。

积Fuzzy判决的FLP问题的最优解

研究了FLP问题的积Fuzzy判决，一般认为：在Fuzzy判决这一步中，用乘积来代替交运算导出的规划往往是非线性的，求解比较困难[3]。文献[1]指出在[0,1]上的图形是连续的分段曲线，每段是二次凸弧，积最优解必在（０,１）内的分界点或驻点取得。本文给出的结论是：若有驻点，则驻点是唯一的，且该驻点就是最优点。

FLP介导的酿酒酵母rDNA多拷贝定点整合

构建了一个带有ＦＲＴ位点以及启动子缺陷的ＵＲＡ３ｄ 选择标记的环状质粒，并通过位点特异性重组将其整合到酵母染色体ｒＤＮＡ中放置的一个ＦＲＴ位点上。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明若处于很强的选择压力下，该质粒的拷贝数会发生有效的扩增。为了证明该质粒能够作为表达载体， 将乙肝融合表面抗原ＳＡ－２８基因的表达单元插入该质粒后整合到ｒＤＮＡ位点。与ｒＤＮＡ位点整合了单个表达单元的菌株相比，ＳＡ－２８蛋白的表达量提高了３０～６０倍。

鸡传染性支气管炎病毒H株纤突蛋白基因的RT-PCR/RFLP分型

A 1.66 kb expected S1 gene fragment of avian infectious brochitis virus (IBV) H strain was amplified by RT PCR. Its PCR/RFLP pattern was similar to IBV D 41 strain and M 41 strain when digested using BstYI, HaeⅢ and EcoRI respectively. IBV H strain was thought as Massachusetts serotype.

东北梅花鹿居群内亲缘关系的AFLP指纹分析

用扩增片段的长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)标记分析研究了东北梅花鹿同一居群内27个个体的亲缘关系,并以此作为优良种鹿选育种的辅助手段。筛选出9对AFLP引物组合,用EcoRⅠ/MseⅠ双酶切,对27只东北梅花鹿基因组DNA进行AFLP检测,共获得15 169条扩增带,检测出多态性条带11 443,多态性比率78.43%,平均每对引物检测到1 271个多态性位点。群体内相似系数AFLP研究结果,平均为0.7841(0.6809-0.8648),27只鹿聚为Ⅰ和Ⅱ两大类群,Ⅱ大类群分为5组,说明该鹿群个体间有较丰富的遗传变异,且与人工定向选配种有关。Ⅱ-4组群体内相似系数最高,在0.82以上,个体之间遗传距离最小在0.1354-0.1563之间,与繁殖记录的亲缘关系基本一致。该研究表明AFLP指纹技术用于梅花鹿遗传多态性分析,品种鉴定及亲缘关系分析是可行的。