重组人FLT3配体的克隆、表达及功能鉴定

通过克隆人FLT3配体 (rhFL)基因 ,建立其原核高效表达系统 ,为大规模获得rhFL产品 ,促进干细胞体外扩增移植等新技术在临床的应用创造条件。分离人外周血单个核细胞 ,提取总RNA ,采用RT 巢式PCR扩增可溶型FL基因 ,以双脱氧终止法进行DNA序列分析 ;将目的基因与 pProEXHT载体连接 ,重组体引入大肠杆菌并在IPTG诱导下表达 ;亲和层析纯化表达产物 ,观察其刺激CD34 + 细胞增殖的情况。从人外周血单核细胞中克隆得到长 481bp的rhFL基因 ,测序结果与已知人FL基因序列一致 ;rhFL的表达量约占菌体蛋白总量的 15 % ,经亲和纯化纯度达 90 %以上 ;rhFL +G CSF +EPO刺激CD34 + 细胞增殖约 40 0倍。获得了rhFL基因及其在大肠杆菌中的高效表达 ,初步建立了产物纯化途径 ,纯化后的rhFL具有较强的刺激造血干 /祖细胞增殖的能力。

FL对脐血造血细胞长期液体培养的影响

用脐血进行干细胞移植有许多优点，但有一个主要的缺点是可获得的细胞数量有限，因此脐血干细胞的体外扩增对于其临床应用具有重要意义。考察了Ｆｌｔ３配体（ＦＬ）和干细胞因子（ＳＣＦ）、白介素３（ＩＬ３）、ＩＬ６、粒细胞集落刺激因子（ＧＣＳＦ）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭＣＳＦ）的组合对脐血细胞扩增和分化的影响。培养４２ｄ，总细胞最多扩增了３８５３０±１６３．５１倍（ＦＬ＋ＳＣＦ＋ＧＣＳＦ＋ＧＭＣＳＦ），粒细胞巨噬细胞集落形成单位（ＣＦＵＧＭ）在第２８天达到最高，最高扩增了４０９５２±１８９５０倍（ＦＬ＋ＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＩＬ６）。ＦＬ与ＳＣＦ等细胞因子具有协同作用，对所有考察的细胞因子组合中，加入ＦＬ都使总细胞和ＣＦＵＧＭ的扩增倍数增加。ＦＬ＋ＳＣＦ培养的总细胞扩增最小，而ＣＦＵＧＭ长时间保持在较高水平，表明这ＦＬ和ＳＣＦ有利于保持造血干细胞的活性，防止细胞分化。在存在ＧＣＳＦ和ＧＭＣＳＦ的培养中，总细胞获得了最大的扩增，但ＣＦＵＧＭ达到最大后很快下降至０，表明ＧＣＳＦ和ＧＭＣＳＦ促进了细胞的分化。结果提示，细胞因子组合对脐血造血细胞的扩增和分化具有重要的作用，ＦＬ和ＳＣ?

重组人Flt3配体在大肠杆菌中的表达、纯化与功能鉴定

目的 建立重组人Flt3配体 (rhFL)的原核高效表达系统及目标蛋白的纯化途径 ,为大规模获得rhFL产品 ,促进干细胞体外扩增、移植等新技术在临床的应用创造条件。方法 将FL胞外段cDNA与pProEXHT载体连接 ,重组体引入大肠杆菌并在异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导下表达 ;提取包涵体 ,经变性、复性等处理 ,用金属离子螯合层析纯化表达产物 ;观察纯化所得rhFL刺激CD3 4+ 细胞的增殖情况。结果 rhFL的表达量约占菌体蛋白总量的 15 % ,经亲和纯化纯度达 90 %以上 ;rhFL +G CSF +Epo刺激CD3 4+ 细胞增殖约 40 0倍。结论 获得了rhFL在大肠杆菌中的高效表达 ,并初步建立了产物纯化途径 ,纯化后的rhFL具有较强的刺激造血干

Flt3配体胞外域的原核表达纯化及活性鉴定

目的:构建pET32a(+)-hFLext原核表达载体,诱导hFLext蛋白表达、纯化及活性鉴定。方法:以人淋巴细胞cDNA文库为模板,克隆hFLext,构建pET32a(+)-hFLext重组表达载体。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定。细胞增殖实验检测其生物学活性。结果:成功克隆获得hFLext,并构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体。在大肠杆菌BL21,经1mMIPTG30℃诱导12h,成功表达Trx-hFLext融合蛋白,主要以包涵体形式存在。经8M尿素变性包涵体蛋白,逐步透析复性,镍珠亲合层析纯化蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定,成功获得高纯度的Trx-hFLext融合蛋白。细胞增殖实验证实其具有生物学活性,能够有效刺激脐血细胞增殖。结论:成功构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体,表达、纯化了具有生物学活性的Trx-hFLext融合蛋白,为造血干/祖细胞的体外扩增研究奠定了基础。

人IL-3基因原核表达载体的构建及表达

目的:构建人IL-3基因原核表达载体pET32a-IL-3,并在大肠杆菌中诱导表达。方法:通过佛波酯(TPA)和植物球血凝素(PHA)刺激人T淋巴细胞系Jurkat细胞,增加IL-3mRNA表达水平,提取mRNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得cDNA,以Jurkat细胞cDNA为模板,通过PCR方法扩增得到人IL-3基因,将其克隆入原核表达载体pET32a(+)中,将重组质粒转化入大肠杆菌宿主菌株BL21中,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,并通过改变IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等条件最终实现蛋白的可溶性表达。表达产物用SDS-PAGE检测表达情况。结果:酶切鉴定和测序结果证明成功构建了原核表达载体pET32a-IL-3。SDS-PAGE检测结果证明实现了人IL-3基因在大肠杆菌中的可溶性表达。结论:成功构建了人IL-3基因的原核表达载体并在大肠杆菌中获得了良好的表达。