Flt3配体在急性髓系白血病化疗过程中的变化及意义

目的通过检测FLt3配体(FL)浓度在急性髓系白血病患者化疗前后的变化情况,统计分析其与白细胞数量变化的相关性。方法对48例急性髓系白血病患者进行追踪观察,于化疗前、化疗结束后5～7 d和20～30 d取外周血2,0例健康人为正常对照,应用酶联免疫吸附技术(ELISA),检测FL在白血病初治和缓解患者化疗前后浓度的动态变化。结果在急性髓系白血病初治组患者,化疗结束后5～7 d FL浓度明显大于化疗前,且明显大于对照组FL浓度([392±55.07)pg/mL,P<0.05]。在缓解组中,3个阶段的浓度差异无统计学意义(P<0.05),但明显低于对照组FL浓度(P<0.05)。并且根据直线相关分析,FL浓度与外周血白细胞数量呈明显负相关(r=-0.464,P<0.05)。结论在急性髓系白血病化疗后,FL浓度与外周血白细胞总数有一定相关性。FL浓度一定程度上反映了患者的骨髓代偿能力。

重组人FLT3配体的克隆、表达及功能鉴定

通过克隆人FLT3配体 (rhFL)基因 ,建立其原核高效表达系统 ,为大规模获得rhFL产品 ,促进干细胞体外扩增移植等新技术在临床的应用创造条件。分离人外周血单个核细胞 ,提取总RNA ,采用RT 巢式PCR扩增可溶型FL基因 ,以双脱氧终止法进行DNA序列分析 ;将目的基因与 pProEXHT载体连接 ,重组体引入大肠杆菌并在IPTG诱导下表达 ;亲和层析纯化表达产物 ,观察其刺激CD34 + 细胞增殖的情况。从人外周血单核细胞中克隆得到长 481bp的rhFL基因 ,测序结果与已知人FL基因序列一致 ;rhFL的表达量约占菌体蛋白总量的 15 % ,经亲和纯化纯度达 90 %以上 ;rhFL +G CSF +EPO刺激CD34 + 细胞增殖约 40 0倍。获得了rhFL基因及其在大肠杆菌中的高效表达 ,初步建立了产物纯化途径 ,纯化后的rhFL具有较强的刺激造血干 /祖细胞增殖的能力。

恶性造血细胞表面Flt3受体的表达及其对Flt3配体的反应性研究

目的 :研究恶性造血细胞表面Flt3受体的表达 ,TNFα和地塞米松 (DXM )对Flt3受体表达的作用及重组人Flt3配体 (rhFL)对恶性造血细胞增殖的影响。方法 :用流式细胞仪测定 18株体外培养的恶性造血细胞株细胞表面Flt3受体 ,用MTT法测定rhFL对恶性造血细胞增殖的影响。结果 :5株细胞表面存在Flt3受体。B淋巴瘤细胞株Raji、Daudi及多发性骨髓瘤细胞株 82 6 6表达高水平Flt3受体 ;髓系白血病细胞株HL 6 0和多发性骨髓瘤细胞株XG 6表达低水平的Flt3受体。用 10 -6mol/LDXM培养 2 4h后 ,上述细胞Flt3受体表达降低 ;用2 0ng/mlTNFα培养 2 4h后 ,Raji和 82 6 6细胞Flt3受体表达降低 ,HL 6 0和XG 6细胞Flt3受体表达增高 ,Daudi细胞Flt3受体表达不受影响。rhFL在 10～ 10 0ng/ml浓度时 ,刺激Raji和HL 6 0细胞的增殖 (P <0 0 5 ) ,但对绝大多数的恶性造血细胞体外无刺激作用。结论 :多数恶性造血细胞不表达Flt3受体 ;rhFL也不引起此类细胞的增殖。地塞米松降低Flt3受体的表达 ,有可能用于防止或降低FL对部分恶性造血细胞的刺激作用 ,使FL的应用更为安全。

乙型肝炎病毒核心抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建可同时表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和Flt3配体(FL)胞外段的双表达核酸疫苗。方法:将HBcAg和FL胞外段的基因用PCR方法扩增并分别引入相应的限制性内切酶酶切位点,然后克隆入真核双表达载体pIRES,获得含双基因片段的表达质粒;再取该表达质粒中的内部核糖体切入位点(IRES)序列和基因片段克隆入pJW4303载体中,获得相应的双表达核酸疫苗,经筛选鉴定后,以293T细胞瞬时表达检测两基因的表达水平。结果:构建成功以pIRES、pJW4303为载体的4种HBcAg和FL胞外段的双表达核酸疫苗,体外表达证实HBcAg和FL胞外段均能高效表达,基因位于IRES上游时表达水平较高。结论:用IRES元件实现了HBcAg和FL胞外段双表达核酸疫苗的构建,pJW4303为载体的核酸疫苗两基因表达水平优于pIRES为载体的核酸疫苗。

Flt3配体修饰小鼠肝癌疫苗的制备及其体内抗肿瘤活性观察

目的 :以小鼠 Flt3配体 (murine flt3ligand,m FL )的重组腺病毒载体 (Adm FL )体外感染小鼠肝癌细胞株 Hepa1- 6制备肝癌疫苗 ,并观察其体内抗肿瘤活性。方法 :腺病毒载体体外感染 Hepa1- 6细胞 ,48h后通过载体所携带的绿色荧光蛋白(GFP)的表达检测感染的效率 ;并用 EL ISA方法检测第 0、2、4、6、8天培养上清中 m FL的表达量 ;每天进行细胞计数 (连续 14d) ,观察细胞的体外生长曲线 ;取 5× 10 6个修饰后的 Hepa1- 6细胞接种 C5 7BL / 6小鼠 ,4周后于原接种部位的对侧再接种 2× 10 6个野生型 Hepa1- 6或 EL 4细胞。结果 :Adm FL能有效感染靶细胞 Hepa1- 6 ,培养上清中 m FL表达量在第 2天最高 ,达到 (71.1± 6 .3) ng/ ml,感染后 Hepa1- 6的体外生长未受到明显抑制 ;修饰后 Hepa1- 6细胞的体内成瘤性下降 ;4周后再接种Hepa1- 6细胞 ,肿瘤生长速度明显降低 ;而再接种的 EL4细胞呈渐进性生长 ,与对照组相比无显著差异。 结论 :腺病毒介导的Flt3配体基因修饰后的肝癌细胞的体内成瘤性下降 ,并能激发特异性免疫保护反应 ,是有效的肝癌疫苗。

应用原位双膜法快速筛选人Flt3配体甲醇酵母高表达转化子

原位双膜法是一种基于免疫原理的快速筛选高表达甲醇酵母转化子的方法 ,即首先将固体培养基上的菌落转印至醋酸纤维素薄膜上 ,再利用硝酸纤维素薄膜原位捕获穿过醋酸纤维素薄膜的菌落外泌蛋白 ,然后用免疫方法检测与硝酸纤维素薄膜结合的蛋白 .利用此法筛选到人Flt3配体 (hFL)的甲醇酵母高表达转化子 ,液体诱导表达量约 2 0mg L .ELISA结果证明 ,原位双膜法所得的菌落染色强度与该菌落液体诱导表达水平正相关 .蛋白质印迹结果显示 ,培养上清在 2 5ku处有明显杂交条带 ,而对照组杂交呈阴性 ,且表达量随诱导天数增加 .原位双膜法是一种良好的筛选方法 ,可以快捷、准确地筛选高表达酵母转化子 .

阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血患者干细胞因子和FLT3配体及其受体表达的研究

目的:检测干细胞因子(SCF)与FLT3配体(FL)及其受体在阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)与再生障碍性贫血(AA)的表达情况,探讨2者在PNH与AA发病中作用。方法:用ELISA法检测PNH与AA患者骨髓SCF和可溶性FL的含量,用流式细胞术对AA与PNH骨髓单个核细胞c kit与FLT3的表达进行分析。结果:PNH、慢性AA患者SCF含量分别为(456.8±115.2)、(372.6±111.5),与正常对照组(389.2±123.3)比较差异无统计学意义(P>0.05);PNH、慢性AA患者c kit表达分别为(48.8±15.6)、(39.6±11.5),低于正常对照组(75.2±23.3)。PNH患者FL水平为226.3±50.6,明显高于正常对照组(89.4±20.8),但低于慢性AA(658.2±125.5)(P<0.01);PNH、慢性AA患者FLT3表达分别为(13.2±5.8)、(8.5±2.7),与正常对照相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:干细胞因子、FLT3配体及其受体参与PNH与AA的发病,2者共同的发病机制可能为干细胞因子受体缺陷、免疫紊乱。

Flt3配体胞外域的原核表达纯化及对脐血CD34^+细胞的扩增作用

背景:Fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3配体)是一种重要的生长因子,通过激活特定的酪氨酸激酶受体,调控造血细胞的生长、生存和/或分化,具有促进造血干细胞体外扩增的应用潜力。目的:构建pET32a(+)-hFLext原核表达载体,表达、纯化hFLext蛋白,观察其对脐血CD34+细胞的扩增作用。方法:克隆hFLext,构建pET32a(+)-hFLext重组表达载体。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白。磁珠分选脐血CD34+细胞,单独加入hFLext或联合干细胞因子、血小板生成素孵育1周,观察体外扩增作用。结果与结论:成功克隆hFLext,并构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体。在大肠杆菌BL21成功表达Trx-hFLext融合蛋白,经8mol/L尿素变性包涵体蛋白,逐步透析复性,镍珠亲合层析纯化蛋白,成功获得高纯度的Trx-hFLext融合蛋白。Trx-hFLext融合蛋白不仅具有维持及轻度刺激CD34+细胞体外扩增的作用,并且与干细胞因子及血小板生成素具有协同作用,为造血干/祖细胞体外扩增研究奠定了基础。

重组人Flt3配体在大肠杆菌中的高效表达和生物学活性的鉴定

根据天然的人Flt3配体(Flt3ligand,FL)基因和遵循适合大肠杆菌BL21(DE3)表达体系表达条件及不改变FL天然蛋白氨基酸序列的原则,对其进行改造,所获得的FL功能片段(FL134)克隆入PET30a表达载体,在C端融合了6个His,继而在大肠杆菌中诱导表达。结果表明重组蛋白rhFL134以包涵体形式在大肠杆菌(BL21)中可得到较高水平的表达。通过蛋白的变性、复性和HiTrapTM亲和层析获得了纯度达92%以上的rhFL134重组蛋白。体外的活性实验显示,重组蛋白rhFL134具有显著的促小鼠骨髓细胞的集落形成和扩增人脐带血中的CD34+细胞的生物学活性。

Flt3配体在肿瘤免疫治疗中的应用

肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病,因此,有关肿瘤早期诊断和治疗一直是科学研究的热点问题。近年针对肿瘤患者的免疫监视功能缺损,以提高树突状细胞(DC)、T细胞及NK细胞介导的肿瘤免疫治疗为策略的癌症治疗方法已经取得了多项进展,基于Flt3配体(FL)免疫治疗就是其中之一。FL是主要表达于造血干细胞/祖细胞上的Ⅲ型酪氨酸激酶受体Flt3的配体,是一种与早期造血调控有关的生长因子。FL联合其他细胞因子,能够在体内外显著地扩增DC,刺激T细胞和NK细胞增殖,为肿瘤免疫治疗提供了良好的基础。目前采用FL治疗乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、颅内肿瘤等,已经显示了其在肿瘤免疫治疗领域中的良好临床应用前景。

人Flt3配体基因的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的克隆人Flt3配体(Flt3 LIg and,FL),并在CHO细胞中进行表达。方法从健康人外周血中提取总RNA,通过RT-PCR技术,扩增Flt3配体胞外区cDNA功能性片段,经DNA测序证实后,将得到的片段基因插入pcDNA3.0表达载体,构建了pcDNA3.0-FL真核表达载体;将重组质粒pcDNA3.0-FL转染CHO细胞,经G418筛选出阳性细胞克隆,扩大培养,提取细胞总蛋白,用SDS-PAGE分离并Western blotting检测到在相对分子质量约24 000处有一显色条带。结果FL胞外区cDNA被正确克隆到真核表达载体pcDNA3.0中并在CHO细胞中成功表达。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-FL并在CHO细胞中成功表达,为FL的相关研究和应用开发奠定了基础。

Flt3配体对培养的树突状细胞免疫表型影响的研究

目的 研究早期造血生长因子 Flt3配体 ( Flt3L)对培养的树突状细胞 ( Dendritic Cell,DC)免疫分子表达的影响。方法 分离正常人外周血中单核细胞 ,以加入细胞因子 rh GM- CSF和 rh IL- 4的培养体系为基础 ,体外培养树突状细胞。观察加入 Flt3L因子后培养的 DC的形态变化 ,并应用流式细胞仪分析DC表面的免疫分子的表达。结果 Flt3L能协同 GM- CSF、IL- 4作用扩增 DC。

Flt3配体免疫佐剂作用的研究进展

Flt3配体(FL)是近年来发现的早期造血细胞生长因子,能在体内、体外扩增树突状细胞(DC),特别对DC1亚群的扩增作用更为明显。大量的研究证实了FL能有效提高HIV、HCV、HBV和肿瘤疫苗的细胞免疫应答水平,展示了FL在治疗性疫苗中的应用前景;同时也发现FL不仅有单纯的免疫增强作用,其也能诱导免疫耐受,显示了FL生物学作用的多样性和复杂性。

重组腺病毒介导的FLT3配体和阿霉素联合治疗小鼠肝癌

目的:将重组腺病毒介导的FLT3配体(FLT3 ligand,FL)与阿霉素(adriamycin,ADM)联合治疗小鼠肝癌,探索基因治疗和化疗相结合治疗肿瘤的新方法。方法:构建携带鼠FL的重组腺病毒载体(AdmFL),单独用其或ADM以及两者联用对实验性肝癌小鼠进行治疗,观察抗肿瘤效果。结果:(1)FL+ADM组小鼠肝癌生长抑制率最大值为56.5％,明显高于ADM组和FL组的27.5％和26.6％(P<0.01);(2)FL+ADM组小鼠早期死亡率为8.3％,明显低于ADM组的37.5％(P<0.01);FL十ADM组小鼠长期生存率为86.4％,明显高于ADM组和FL组的50.0％和41.5％(P<0.01)。结论:(1)FL和ADM治疗小鼠肝癌具有协同作用,FL可显著增强化疗效果;(2)FL能明显降低化疗不良反应。

两个新的人Flt3配体差异剪接体的克隆

目的 :寻找新的人 Flt3配体 (h FL )的差异剪接体。 方法 :从健康志愿者外周血中分离单个核细胞 ,一步法提取总RNA ,逆转录成 c DNA,应用胞外区特异性引物 PCR扩增 h FL的胞外区并克隆至真核表达质粒 ,进行序列测定分析。 结果 :序列分析发现了两个新的 h FL的差异剪接体 ,均发生在重要的第 5外显子功能域 ,分别在 434 bp处有一个胞嘧啶的插入和在42 6～ 478bp之间缺失了 5 3个 bp。 结论 :h FL存在两个新的差异剪接体 ,此项发现为进一步的功能研究提供了基础。

PNH患者SCF、FLT3配体及其受体表达的研究

采用酶联免疫吸附法检测阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)患者的骨髓干细胞生长因子(SCF)和FLT 3配体(FL)及其受体含量,用流式细胞术对患者骨髓单个核细胞c k it与FLT 3的表达进行分析。结果与对照组比较,PNH患者的SCF无统计学差异(P>0.05),c k it表达明显降低(P<0.01),FL含量明显升高(P<0.01),FLT 3表达与对照组比较P>0.05。提示SCF、FL及其受体可能参与PNH的发病。

Flt3配体潜在的临床应用前景

Flt3配体是新近克隆的早期造血生长因子 ,具有刺激造血和调节免疫的双重作用 ,在造血干细胞动员、保护大剂量放化疗对骨髓的损伤、激发有效的抗肿瘤免疫、诱导主动的移植免疫耐受和调节肠道黏膜免疫等多个方面均有很好的临床应用前景。

Flt3配体抗肿瘤作用研究进展

Flt3配体 (FL)是一种能够刺激早期造血的细胞因子。FL可促进体内树突状细胞、自然杀伤细胞、细胞毒T淋巴细胞的增殖、分化和成熟 ,从而具有重要的抗肿瘤免疫治疗作用。对乳腺癌、纤维母细胞肉瘤、肝癌、淋巴瘤等肿瘤的体内、外实验亦证实FL对肿瘤生长的抑制作用。本文就FL的主要生物学特性。

动态测定急性白血病化疗过程中flt3配体水平变化及意义

目的 :研究急性白血病 (AL )化疗前后骨髓及外周血 FL含量变化及其来源。方法 :夹心酶联免疫吸附法 (Elisa法 )分析了 AL化疗前后骨髓及外周血 flt3配体 (FL )水平变化 ,并应用免疫荧光单标记和双标记流式细胞仪检测技术跟踪确定 FL 的主要产生细胞。结果 :T、B淋巴细胞及单核细胞膜表面仅表达少量膜型 FL;细胞经用皂素穿孔及双标记分析发现 FL 主要贮存在 CD3+细胞内 ;AL 患者化疗前骨髓及外周血 FL 含量略高于正常对照 ,与正常对照无区别 (P >0 .0 5 )。化疗后 FL 水平升高 ,与患者外周血象呈负相关 (r =- 0 .73,P <0 .0 5 ) ,流式细胞分析则提示细胞内 FL 含量减少 ,而细胞膜 FL 表达显著增加。结论 :AL 患者过程中 FL 水平升高与骨髓抑制程度相关 ,FL主要来自 CD3+ 细胞。

Flt3配体研究进展

Flt3配体 (FL)是新近发现的、能够刺激早期造血的细胞因子。该因子通过与酪氨酸激酶受体 3(Flt30 )结合 ,刺激造血干细胞的增殖和分化 ,增加淋巴细胞、树突状细胞 (DC)、自然杀伤 (NK)细胞及体外长期培养的干细胞等的数量。最近的研究还发现 ,FL通过促进体内DC、NK细胞、细胞毒T细胞 (CTL)的增殖、分化和成熟 ,发挥抗肿瘤作用。本文对FL的基因克隆及蛋白质结构作一简单介绍 ,并重点对近年来FL生物学特性研究状况作一综述。