PREPARATION OF N－t－BUTYLOXYCARBONYL－O~α－9－FLUORENYLMETHYL ESTER OF ASPARTIC ACID

The preparation of the a carboxyl 9-fluorenylmethyl(FM) ester of Boc-aspartic acid is described.This new protected amino acid linked to the polymeric support by βcarboxyl group offers a convenient strategy for the synthesis of head-to-tail cyclopeptides while the peptides remained attached to the polymeric support.

柱前衍生-超高效液相色谱-串联质谱测定茶叶中草甘膦、草铵膦及主要代谢物氨甲基膦酸残留

采用柱前衍生-超高效液相色谱-串联质谱测定茶叶中草甘膦、草铵膦及其主要代谢物氨甲基膦酸残留。利用正交试验方法,系统研究了提取与净化等前处理条件对茶叶中草甘膦、草铵膦和代谢物氨甲基膦酸检测的影响。实验结果表明,最优的前处理方案为茶叶样品经纯水旋涡提取,阳离子交换柱净化,0.5%(v/v)甲酸水溶液洗脱和9-芴甲基氯甲酸酯衍生,C_(18)色谱柱分离,超高效液相色谱-串联质谱定量分析(电喷雾正离子)。结果表明:在1~100μg/L范围内,草甘膦、草铵膦和氨甲基膦酸呈现良好的线性关系,相关系数(R^2)均大于0.991,该方法检出限为0.016 0~0.030 0 mg/kg,定量限为0.053 0~0.100 mg/kg。在0.050 0、0.400和1.20 mg/kg 3个添加水平下,草甘膦、草铵膦和氨甲基膦酸的平均回收率为78.3%~108%,相对标准偏差为5.46%~9.63%。利用该方法检测837份茶叶中草甘膦、草铵膦和氨甲基磷酸残留,检出率分别为3.46%、0.24%和4.42%,超标率为0.24%。该方法简单、快速、灵敏、准确,能够满足大批量茶叶中草甘膦、草铵膦和氨甲基膦酸残留的检测需要。

柱前衍生反相高效液相色谱法测定小麦中氨基酸含量

以肌氨酸为内标物,邻苯二甲醛-9-芴甲基氯甲酸酯为柱前衍生剂,用ODS色谱柱在柱温40℃下,采用二元梯度洗脱,DAD检测器在338 nm波长处检测,建立了一种利用反相高效液相色谱同时测定小麦籽粒中17种氨基酸的方法.氨基酸浓度在5～800 μmol/L范围内,其峰面积与内标物峰面积的比值和氨基酸浓度的线性相关系数均大于0.996;17种氨基酸的加标回收率在97.5%～103.1%范围内.应用本方法对小麦籽粒中氨基酸含量进行测定,取得了较理想的结果.同时,本法还可应用于糙米和玉米等粮食中氨基酸含量的测定.

柱前衍生化高效液相色谱法测定三七及其制剂中三七素含量

目的：建立三七药材及其制剂中三七素含量测定的方法。方法：以硼砂缓冲液（pH9．18）为提取溶剂，回流提取药材及制剂中的三七素；以氯甲酸芴甲酯（FMOC）作为衍生化试剂，对三七素提取液进行柱前衍生化，采用RP-HPLC，ODS柱分离，并通过紫外检测的方法进行测定。结果：在本实验条件下，三七素的线性范围为1．76-352mg·L^-1，最低检测限为60μg·L^-1。衍生化产物稳定，过量的衍生化试剂无干扰。平均加样回收率为95．3％，RSD为1．7％。结论：该方法操作简单，快速，灵敏度高，可用于三七药材及制剂中三七素的分析测定和三七素的药物代谢研究。

Pronase E酶解释放糖蛋白N-糖链的方法及荧光标记衍生物的LC-MS分析

建立了一种用非特异性酶链酶蛋白酶E(Pronase E)从糖蛋白上释放N-糖链的方法.以牛胰核糖核酸酶B(Ribo B)和鸡白蛋白(Chicken Albumin)为材料,用Pronase E代替N-糖苷酶F(PNGase F)释放N-糖链.当蛋白酶质量与糖蛋白质量比为1∶1时,得到只带一个天冬氨酸(Asn)的闭环N-糖链,称其为糖氨酸(gly-can-Asn),这样既为糖链引入了天然的-NH2活性基团,同时还保持了糖链原有的还原端闭环结构.以9-氯甲酸芴甲酯(Fmoc-Cl)为衍生试剂对解离后的糖氨酸进行衍生,采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(HPLC-ESI/MS)对Fmoc-Cl糖氨酸衍生物进行分析,建立了糖蛋白的Pronase E酶解、微量糖氨酸的Fmoc-Cl衍生以及糖氨酸衍生物的HPLC-ESI/MS分析方法,该方法保持了N-糖链的天然结构,便于以-NH2为功能基团进一步进行荧光标记、分离制备以及糖链与蛋白质的相互作用研究.

反相高效液相色谱法测定桑枝中1-脱氧野尻霉素的含量

目的建立测定桑枝中1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量的方法。方法采用9-芴基氯甲酸甲酯标记、配有荧光检测器的反相高效液相色谱法,色谱柱为DIAMONSIC C18柱(4.60mm×250mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%醋酸(1∶1),流速为1.0mL.min-1,柱温为室温,检测波长为激发光254nm与发射光322nm,正交法考察反应温度、缓冲液pH值、反应时间3个因素对DNJ衍生化的影响。结果DNJ在3.6～36mg.L-1内具有良好的线性关系(r=0.9999,n=5),检测限为0.08mg.L-1(S/N=3),平均回收率为99.2%,RSD=3.5%(n=5),在30℃,pH7下反应50min,为DNJ衍生化的理想条件。桑枝富含DNJ,其含量在桑品种、生长季节和老嫩程度间存在显著差异。结论方法准确灵敏、快速简便,可用于桑枝及其制品中DNJ含量的大数量样本测定。DNJ在桑枝中具有一定的累积作用。

反相高效液相色谱法测定血清中γ-氨基丁酸

建立一种高灵敏度的氯甲酸芴甲酯柱前衍生荧光检测反相高效液相色谱法测定血清中γ氨基丁酸的方法．内标为己氨酸，固定相为ＳｈｉｍＰａｃｋＣＬＣＯＤＳ（Ｍ），４６ｍｍ×１５０ｍｍ，填充料为５μｍ；流动相采用二元梯度洗脱，Ａ相为００５ｍｏｌ／Ｌ醋酸钠缓冲液∶水∶四氢呋喃∶冰乙酸（２５０∶１００∶１５∶２２），Ｂ相为乙腈∶甲醇（４∶１）．系统研究了ｐＨ值、反应时间、离子强度及衍生化试剂用量对衍生化反应的影响，确定最佳反应条件和最佳色谱条件．方法的精密度为批内变异系数＜４６％，批间变异系数＜６１％；最低检出限（信噪比＝２）为３１ｎｍｏｌ／Ｌ；线性范围为５０～１０００ｎｍｏｌ／Ｌ，γ２＝０９９９２；平均回收率为９７１％．

柱前衍生-高效液相色谱法测定保健食品中16种氨基酸的含量

目的建立柱前衍生-高效液相色谱法测定保健食品中16种氨基酸的含量。方法优化GB/T5009.124-2003的前处理方法,样品经稀释或置于顶空瓶中直接酸水解;并采用OPA/FMOC柱前衍生法,色谱柱为Thermo ODS Hypersil,以醋酸钠缓冲液（含三乙胺、四氢呋喃）和醋酸钠缓冲液（含乙腈、甲醇）为流动相进行梯度洗脱,在338 nm和262 nm检测波长下进行高效液相色谱法检测。结果 16种氨基酸在4-250μg/mL范围内呈现良好线性关系,在10μg/mL水平下加标回收率为85.8%-115.2%,RSD为0.1%-9.1%（n=6）,检出限在0.2-4.6 ng范围内。结论本方法操作简便、灵敏度高,可应用于实际样品的测定。

高效液相色谱法测定人血浆中托吡酯的浓度

目的：建立高效液相色谱法测定人血浆中托吡酯的浓度。方法：采用氯甲酸芴甲酯为柱前衍生化试剂，高效液相色谱法检测托吡酯衍生物，Shim-pack VP-ODS柱（4．6mm×150mm，5μm）；流动相：0．05mol·L^-1。磷酸二氢钠（pH2．4）-甲醇（20：80）；流速：1．0mL·min；柱温：25℃；检测波长：264nm；进样量：20μL。结果：标准曲线线性范围为40～5000μg·L^-1（r=0．9998，n=7），血浆中托吡酯最低检测限为10μg·L^-1,日内RSD为1．68％～4．12％，日间RSD为2．54％-3．92％，托吡酯回收率为98．0％～101．3％。结论：本法快速简便、灵敏准确，适用于临床常规监测需要。

柱前衍生HPLC法检测罗非鱼肌肉中的硫酸新霉素

硫酸新霉素本身没有紫外吸收,必须通过柱前衍生来进行荧光检测,建立合适的衍生方法是提高检测灵敏度的关键。通过对硫酸新霉素衍生方法的优化,确定衍生化学试剂氯甲酸戊甲酯乙腈溶液的浓度为8 mmol/L,在pH值为7.8的硼酸缓冲液中衍生反应15 min,10 h内检测可得到理想的结果。对硫酸新霉素检测方法优化后,该药物在罗非鱼肌肉中检测限可达到0.02mg/kg,定量限为0.05 mg/kg,在0.05~5 mg/kg浓度范围内有良好的线性关系（r2=0.9956）,在肌肉中分别按照0.10、0.50、1.00 mg/kg的标准添加硫酸新霉素,回收率分别为76.43±1.46%、79.47±1.71%、86.82±1.13%。

氯甲酸芴甲酯柱前衍生高效液相色谱法测定植物中多胺

建立了一种采用氯甲酸芴甲酯进行柱前衍生，高效液相色谱分离和测定植物中游离 态和结合态多胺的新方法。腐胺、精脒和精胺的分离在 １６ｍｉｎ内完成；检出限分别达到 ０．０３０、０．０１８和０．０２３ｐｍｏｌ；线性动态范围至少是３个数量级。研究了反应温度和时间对荧光 衍生物产率的影响，指出在２５℃下反应２０ｍｉｎ可获得较高产率。多胺总量与衍生试剂的摩 尔比超过１：８时，荧光衍生物产率恒定。本方法用于苹果和番茄样品的测定，并进行了回收 率试验。腐胺、精脒和精胺的５次测定ＲＳＤ％分别为１．１１％～３．４１％，１．４９％～２．９１％， １．５９％～３．１４％；回收率分别为９７．５％～１０３．２％，９８．６％～１０２．２％，９８．４％～１０２．４％。

柱前荧光衍生化HPLC-RIF法测定人血清托吡酯浓度

目的:建立血清中托吡酯(topiramate,TPM)浓度的高效液相色谱-荧光测定法。方法:选用金刚烷胺为内标,以二氯甲烷萃取血清中的托吡酯,经氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)衍生化后用HPLC法对衍生产物进行分析。以pH6乙腈-磷酸盐缓冲液为流动相,流速1 ml·min^(-1)梯度洗脱;荧光检洲器检测波长为315 nm,激发波长为260 nm。结果:色谱图中TPM衍生物与杂质峰分离良好,血清中的内源性杂质无干扰。TPM在0.25～25μg·ml^(-1)浓度范围内有良好的线性关系(r=0.999 1,n= 6),最低检测限为0.25μg·ml^(-1)。日内与日间RSD均<10.0%。结论:本法可以测定人血清中托吡酯浓度。

氯化血红素-空气催化氧化体系应用于利那洛肽的合成

目的使用氯化血红素催化氧化的方法合成利那洛肽。方法采用9-芴甲氧头羰基(Fmoc)固相合成策略,以Wang树脂为载体和三苯甲基(Trt)为保护基的半胱氨酸合成利那洛肽线性肽,使用氯化血红素-空气催化氧化体系一步氧化法构建3对二硫键,并与传统的空气、二甲基亚砜和碘(I2)氧化法进行了对比。结果和结论相对于传统氧化法,氯化血红素催化氧化法可更快速、更高效地得到目标利那洛肽,为多肽合成中的二硫键形成提供一种新的方法。

痕量神经肽的高效液相色谱

本文选用芴甲氧羰基氯(FMOC-CL)作为肽的荧光衍生试剂,建立了两段淋洗分离测定神经肽RP-HPLC的方法。衍生反应简便、快速、衍生物稳定。FMOC-脑啡肽、FMOC-P物质在18min内全部被洗脱。本方法在1～100pmol具有良好的定量线性关系。当信噪比为2.5:1时,检测极限:FMOC-甲硫脑啡肽为405fmol,FMOC-亮脑啡肽337fmol,FMOC-P物质为500fmol。并且能够容易地脱去衍生基团得到反应前的神经肽。

反相高效液相色谱分离五种常见的氨基酸

建立了以9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)为柱前衍生试剂,反相高效液相色谱成功分离五种常见氨基酸(谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸)的分析方法,在最优化的色谱分离条件下,五种衍生产物得到了完全分离,在0.0125～0.2 mmol/L范围内,峰面积与氨基酸浓度之间的线性相关系数为0.9920～0.9979。

水中草甘膦和氨甲基膦酸的柱前衍生-液相色谱方法研究

建立柱前衍生－液相色谱－荧光检测法同时测定水中草甘膦和氨甲基膦酸的方法。水样经芴甲氧羰酰氯衍生化后取上清液进样，采用 ODS C 18柱，以水（5 mmol ／L 乙酸铵）－乙腈作为流动相进行梯度洗脱，采用荧光检测器进行检测。实验通过加入柠檬酸三钠，解决了实际水样中金属阳离子的干扰问题。草甘膦和氨甲基膦酸在一定范围内线性良好（r ＝0．9973～0．9990），回收率为92．2％～102％，相对标准偏差为4．3％～8．5％，方法检出限为1．29μg ／L 和1．84μg ／L。

FMOC-Cl柱前衍生高效液相色谱法测定乳中庆大霉素

建立一种简捷、快速的高效液相色谱法测定原料奶中庆大霉素的残留。庆大霉素经氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）衍生化后用HPLC法分析。采用Diamonsil-C18（250 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱,以乙腈-水（75∶25,V/V）为流动相,荧光检测器激发波长为350 nm、发射波长为450 nm。回收率在88.8%～93.2%,精密度（RSD）为1.85%～3.41%,检出限分别为1.5μg/mL。该方法可用于原料奶中庆大霉素残留的检测。

柱前衍生反相高效液相色谱-荧光检测法测定大鼠血浆中的奈替米星

建立了一种简便、灵敏的氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)柱前衍生反相高效液相色谱-荧光检测血浆中奈替米星的新方法,同时研究了其药代动力学。对色谱条件进行了优化,采用ZORBAX Eclipse XDB-C8柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-水(体积比为85∶15),流速为1.0mL/min,荧光检测激发波长为265nm,发射波长为315nm,得到奈替米星的平均加标回收率为96.62%～100.84%(n=3),对奈替米星检测的线性范围为0.045～8.88mg/L,相关系数为0.999 3,方法的日内与日间精密度分别低于3%与3.5%,最低检出限(S/N=3)与定量限(以3倍检出限计)分别为0.01和0.03mg/L。方法简便、快速、灵敏,样品用量少(30μL奈替米星血浆溶液已能满足该药含量的测定以及药物代谢的研究),为大鼠体内奈替米星的药代动力学研究提供了可靠的分析手段。

HPLC法定量分析微生物法制备液中产物γ-氨基丁酸和底物L-谷氨酸

建立一种测定微生物法制备液中γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）和L-谷氨酸（L-glutamic,L-Glu）的高效液相色谱法.样品经10％三氯乙酸溶液预处理后,用4 mmol/L氯甲酰芴甲酯进行柱前衍生.采用Phenomenex C18色谱柱（4.6 mm＆#215;250 mm,5 μm）,以A[50 mmol/L乙酸钠溶液（pH 4.8）-甲醇-乙腈-四氢呋喃（82∶8.5∶8.5∶1,V/V）]：B[50 mmol/L乙酸钠溶液（pH 4.8）-甲醇-乙腈-四氢呋喃（22∶38.5∶38.5∶1,V/V）]=30∶70为流动相,流速1.0 mL/min,柱温40℃洗脱,检测波长265 nm.该方法稳定、灵敏、测定周期短、重复性好.在GABA和L-Glu质量浓度为20～400 μg/mL范围内有良好的线性关系.与常用衍生剂邻苯二甲醛相比,衍生产物的稳定性更好,且无需梯度洗脱.

保护氨基酸Fmoc-His(Trt)-OH的合成方法优化

在肽合成中,为了得到理想的目的肽,首先需要对氨基酸的活性基团加以封闭或保护。叔丁氧羰基(Boc)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)是固相合成中首选的-αNH2保护基,由此形成了多肽固相合成方法中的两大类:Boc方法和Fmoc方法。组氨酸(His)是多肽合成中问题最大的氨基酸之一,需要对其α-氨基及侧链上的咪唑环加以保护。由于Fmoc保护基的一些独特优点,如对碱的不稳定性、易检测性等,因此,我们选择Fmoc为其-αNH2保护基。在Fmoc策略合成过程中,三苯甲基(Trt)对缩合以及脱保护条件都很稳定,它可被稀乙酸在稍高的温度条件下,或TFA在室温脱除,因而选用Trt封闭咪唑环上的活性官能团。实验通过中心曲面实验设计方法和正交实验设计方法对His的两步保护反应条件进行优化,使得最终两步反应收率分别都达到80%以上,产品纯度达到95%以上。