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用大肠杆菌表达FMDV NSP3ABC鉴别感染与注苗动物ELISA方法的建立 被引量:14
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作者 曹轶梅 卢曾军 +1 位作者 刘在新 谢庆阁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期381-386,共6页
用大肠杆菌表达的FMDV NSP3ABC经纯化复性后作为抗原,建立了鉴别感染动物与注苗动物的间接ELISA方法。用该方法检测了大量的牛血清样品,确定了3ABC-I-ELISA判定标准。3ABC-I-ELISA以(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)来计算待测样... 用大肠杆菌表达的FMDV NSP3ABC经纯化复性后作为抗原,建立了鉴别感染动物与注苗动物的间接ELISA方法。用该方法检测了大量的牛血清样品,确定了3ABC-I-ELISA判定标准。3ABC-I-ELISA以(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)来计算待测样品效价。当效价小于012为阴性,介于012~013之间为可疑,大于013为阳性。根据此判定标准所测试验感染动物血清都为阳性,敏感性达100%;97.06%疫苗注射动物血清为阴性;98.39%的非免疫健康牛(未感染也未注射疫苗牛)血清为阴性。研究证实感染牛在1年以后仍能检测到3ABC抗体。这说明3ABC-I-ELISA能够鉴别FMDV感染动物和注苗动物,可作为大面积疫情监测的方法应用。 展开更多
关键词 大肠杆菌表达 鉴别 间接ELISA方法 fmdv 感染动物 判定标准 动物血清 血清样品 疫苗注射 注射疫苗 方法应用 疫情监测 阳性 敏感性 健康牛 检测 效价 抗原 后作 免疫 抗体
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1-2月龄荷斯坦奶牛不同组织中FMDV受体亚基αv、β3、β6mRNA转录水平的相对定量研究 被引量:5
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作者 独军政 常惠芸 +6 位作者 薛霜 高闪电 丛国正 邵军军 林彤 包慧芳 才学鹏 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期605-611,共7页
【目的】建立检测牛口蹄疫病毒(FMDV)受体亚基αv、β3、β6 mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,分析受体αvβ3和αvβ6在不同器官组织中的转录水平。【方法】在对牛FMDV受体基因克隆和测序的基础上,设计实时定量PCR引物,以GAPDH为内... 【目的】建立检测牛口蹄疫病毒(FMDV)受体亚基αv、β3、β6 mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,分析受体αvβ3和αvβ6在不同器官组织中的转录水平。【方法】在对牛FMDV受体基因克隆和测序的基础上,设计实时定量PCR引物,以GAPDH为内参基因,采用△△Ct相对定量PCR方法检测分析FMDV受体亚基αv、β3、β6 mRNA在1—2月龄荷斯坦奶牛体内不同器官组织中的转录表达谱。【结果】αvβ3在荷斯坦奶牛24种组织中均有不同程度的转录表达;αvβ6在甲状腺、硬腭、鼻内皮、喉头、肺、食管、肾、后蹄冠状带等组织表达量较高,在唇、舌皮、软腭、气管、心脏、瘤胃、直肠、前蹄冠状带等组织转录表达量适中,在唾液腺、下颌淋巴结、肝、脾、肌肉等组织未检测到表达;αvβ6在牛体内的表达分布与FMDV组织嗜性基本一致,αvβ6受体可能是决定FMDV组织嗜性的主要功能受体,αvβ3的组织分布似乎与FMDV组织嗜性无关,但不能排除αvβ3在病毒感染过程中的作用。【结论】建立了检测FMDV受体亚基mRNA在不同器官组织中表达水平的相对实时定量PCR方法。 展开更多
关键词 fmdv受体 mRNA转录水平 SYBR Green I 荷斯坦奶牛
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构建多顺反子表达载体的有效工具——FMDV 2A 被引量:12
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作者 刘必胜 刘新垣 钱程 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期765-769,共5页
近年来肿瘤多基因治疗倍受关注,然而目前缺少一种有效的构建多顺子的工具。传统的构建多顺反子的工具,如IRES等,由于存在结构大,上下游基因表达差异显著等缺陷,严重限制了其应用。FMDV2A,因其具有结构小、剪切效率高等优点为多基因治疗... 近年来肿瘤多基因治疗倍受关注,然而目前缺少一种有效的构建多顺子的工具。传统的构建多顺反子的工具,如IRES等,由于存在结构大,上下游基因表达差异显著等缺陷,严重限制了其应用。FMDV2A,因其具有结构小、剪切效率高等优点为多基因治疗带来了新的希望。主要介绍了FMDV2A的特性、"剪切"活力及其在构建多顺反子载体中的应用。 展开更多
关键词 fmdv 2A 多顺反子 基因治疗 肿瘤
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重组伪狂犬病病毒TK^-/FMDV VP1的构建 被引量:3
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作者 卜春玲 罗满林 +2 位作者 刘镇明 黄毓茂 贺东生 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期241-244,269,共5页
以伪狂犬病病毒 (PRV)为载体表达其他病原体抗原蛋白是伪狂犬病疫苗研究的一个重要方向。本文以广东地方分离株 (以下简称YA)为亲本株 ,用PCR方法得到同源左右臂 ,然后将重组转移载体和PRVYA的基因组共转染 ,用BUDR筛选出了表达口蹄疫病... 以伪狂犬病病毒 (PRV)为载体表达其他病原体抗原蛋白是伪狂犬病疫苗研究的一个重要方向。本文以广东地方分离株 (以下简称YA)为亲本株 ,用PCR方法得到同源左右臂 ,然后将重组转移载体和PRVYA的基因组共转染 ,用BUDR筛选出了表达口蹄疫病毒 (Foot_and_MouthDiseaseVirus ,FMDV)结构蛋白VP1的TK_重组病毒 ,用PCR和SDS -PAGE的方法对VP1蛋白进行了初步鉴定 。 展开更多
关键词 重组伪狂犬病病毒 TK基因缺失疫苗 fmdv VP1
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Asia 1型FMDV感染BHK-21细胞差异蛋白质点2-DE分析 被引量:4
5
作者 刘永杰 张克山 +5 位作者 尚佑军 郭建宏 郑海学 田宏 卢国栋 刘湘涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期145-149,共5页
为研究Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)感染BHK-21细胞后蛋白质组的变化及差异,将FMDV接种于培养的单层BHK-21细胞,同时设未接毒的BHK-21细胞作对照组。待细胞病变后分别提取2组细胞总蛋白借助2-DE技术及PDQuest8.0软件进行细胞蛋白质组二维... 为研究Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)感染BHK-21细胞后蛋白质组的变化及差异,将FMDV接种于培养的单层BHK-21细胞,同时设未接毒的BHK-21细胞作对照组。待细胞病变后分别提取2组细胞总蛋白借助2-DE技术及PDQuest8.0软件进行细胞蛋白质组二维电泳图谱差异性分析。结果显示感染组有1 457个可见蛋白质点,而对照组可见的蛋白质点为1 427个。感染组蛋白点的表达量与对照组相比,二者具有统计学差异(P<0.05)的蛋白质点472个,其中表达上调251个点,表达下调221个点,新合成蛋白点30个。结果表明FMDV感染BHK-21细胞后引起了细胞蛋白质组表达模式的改变,这种变化是病毒与细胞相互作用的结果。本研究首次利用蛋白质组学技术研究Asia 1型FMDV感染BHK-21细胞后蛋白质组学差异,有助于深入研究Asia 1型FMDV和BHK-21细胞相互作用的分子机制。 展开更多
关键词 Asia1型fmdv BHK-21细胞 感染 差异蛋白质组
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细菌内同源重组法制备FMDV聚蛋白编码基因重组腺病毒 被引量:3
6
作者 张兴旺 王勤 +2 位作者 柳纪省 殷相平 李志勇 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期223-226,共4页
采用PCR方法从重组质粒pMD18_T/PP中扩增出FMDV的聚蛋白(PP)编码基因,再亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成重组穿梭质粒rpAd_CMV/PP;将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体通过在大肠杆菌内质粒间同源重组获得重组腺病毒质粒rpAd/PP。将腺... 采用PCR方法从重组质粒pMD18_T/PP中扩增出FMDV的聚蛋白(PP)编码基因,再亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成重组穿梭质粒rpAd_CMV/PP;将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体通过在大肠杆菌内质粒间同源重组获得重组腺病毒质粒rpAd/PP。将腺病毒载体线性化后用脂质体介导转染293细胞从而获得含有口蹄疫病毒PP编码基因的重组腺病毒。通过倒置显微镜观测,可见明显的细胞病变,利用荧光显微镜可观测到报告基因绿色荧光蛋白的表达,并在电镜下观察到FMDV的空衣壳。结果证明已成功获得了含有口蹄疫病毒PP编码基因的重组腺病毒rAd/PP,并成功表达组装FMDV空衣壳,为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 fmdv 聚蛋白 编码基因 同源重组 重组腺病毒 空衣壳
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共表达FMDV P1-2A和3C重组鸡痘病毒疫苗与核酸疫苗的实验免疫研究 被引量:4
7
作者 张洪勇 金宁一 +4 位作者 葛淑敏 尹革芬 郑敏 李子健 江文正 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2004年第8期20-23,共4页
将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因分别插入到鸡痘病毒表达载体质粒pUTA-16Lac Z的复合启动子和单一启动子的下游,构建共表达重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL3CP1,与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞,经RT-PCR、... 将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因分别插入到鸡痘病毒表达载体质粒pUTA-16Lac Z的复合启动子和单一启动子的下游,构建共表达重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL3CP1,与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞,经RT-PCR、IFA及Western blotting检测,成功获得能正确表达目的蛋白的重组鸡痘病毒株vU-TAL3CP1。并与FMDV重组核酸疫苗免疫小鼠实验表明,各实验免疫组均能诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫反应,其中以重组鸡痘病毒与核酸疫苗联合免疫效果好于其它实验各组。 展开更多
关键词 fmdv 重组鸡痘病毒疫苗 重组核酸疫苗 免疫原性 口蹄疫病毒
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猪O型FMDV抗体检测试纸条与ELISA对比试验 被引量:3
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作者 杨继飞 杨苏珍 +7 位作者 焦海燕 邓瑞广 杨艳艳 赵东 邢广旭 柴书军 李学伍 张改平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2010年第4期112-115,共4页
为初步评价研制的猪O型FMDV抗体检测试纸条的性能,检测了免疫FMDV多肽疫苗20 d后制备的猪血清(143份),并对比FMDV VP1抗体检测ELISA试剂盒的检测结果。结果显示,二者的符合率为100%。猪O型FMDV抗体检测试纸条特异、敏感、快速、简便,具... 为初步评价研制的猪O型FMDV抗体检测试纸条的性能,检测了免疫FMDV多肽疫苗20 d后制备的猪血清(143份),并对比FMDV VP1抗体检测ELISA试剂盒的检测结果。结果显示,二者的符合率为100%。猪O型FMDV抗体检测试纸条特异、敏感、快速、简便,具有广阔的推广应用前景。 展开更多
关键词 fmdv 试纸条 ELISA 抗体
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含O型FMDVP1-2A、3C基因和EGFP基因表达盒的构建 被引量:2
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作者 王建科 吴国华 +6 位作者 叶奕优 颜新敏 朱海霞 李健 朱彩珠 张强 王雯慧 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期15-20,共6页
采用RT-PCR方法分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMD18-T载体,分别得到重组载体pUC119-P1-2A和pMD18-T-3C;将重组载体pUC119-P1-2A用HindⅢ、BamHⅠ酶切,重组载体pMD18-T-3C用... 采用RT-PCR方法分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMD18-T载体,分别得到重组载体pUC119-P1-2A和pMD18-T-3C;将重组载体pUC119-P1-2A用HindⅢ、BamHⅠ酶切,重组载体pMD18-T-3C用BamHⅠ、NheⅠ酶切;利用酶切所得到的基因片段P1-2A、3C有共同的BamHⅠ酶切位点,实现基因P1-2A、3C的连接,构建重组载体pMD18-T-P1-2A-3C.将基因P1-2A-3C与启动EGFP表达的双向串连痘苗病毒启动子P7.5相连,构建载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C,并进行PCR扩增、酶切鉴定及序列测定.结果表明:试验成功构建了一侧启动表达P1-2A-3C基因,一侧启动表达标记基因EGFP的表达盒p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C. 展开更多
关键词 fmdv 启动子P7 5 P1—2A基因 3C基因
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Expression,Purification and Activity Detection of VP1 of A-type FMDV 被引量:4
10
作者 李菁 林彤 +4 位作者 高闪电 丛国正 独军政 邵军军 常惠芸 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2010年第2期23-26,共4页
[Objective] The research aimed to induce the expression of FMDV structural protein VP1 in E.coli and purify the protein,then detect the activity.[Method] The fragment coding VP1 was amplified by PCR and doubly digeste... [Objective] The research aimed to induce the expression of FMDV structural protein VP1 in E.coli and purify the protein,then detect the activity.[Method] The fragment coding VP1 was amplified by PCR and doubly digested with BamH Ⅰ and XhoⅠ,then cloned into expression vector pGEX-4T-1 and pPROExHTb respectively to get recombinant plasmid pGEX-4T-1-VP1 and pPROExHTb-VP1.The recombinant plasmid pGEX-4T-1-VP1 and pPROExHTb-VP1 was transformed into E.coli BL21(DE3)and induced by IPTG,fusion protein was identifie... 展开更多
关键词 A-type fmdv Structural protein VP1 Expression and purification
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FMDV OH99株基因组全序列的测定及其基因特征研究 被引量:3
11
作者 刘光清 刘在新 +5 位作者 张显升 常惠芸 郭慧琛 李冬 刘相涛 谢庆阁 《中国病毒学》 CSCD 2003年第3期259-264,共6页
采用RT-PCR方法对FMDV OH99株基因组全序列进行了分子克隆与测序。结果表明OH99株基因组全基因组序列长8040nt,其中5’NCR长1026nt,前导蛋白(L)编码区长603nt。该毒株结构蛋白与非结构蛋白编码区的核苷酸序列为6318nt,3’NCR长93nt,其后... 采用RT-PCR方法对FMDV OH99株基因组全序列进行了分子克隆与测序。结果表明OH99株基因组全基因组序列长8040nt,其中5’NCR长1026nt,前导蛋白(L)编码区长603nt。该毒株结构蛋白与非结构蛋白编码区的核苷酸序列为6318nt,3’NCR长93nt,其后是poly(A)尾巴,测序结果表明该结构至少含有56个A。应用分子生物学软件,将OH99株与其它参考毒株进行了序列比较,并对其基因特征、推导的氨基酸序列进行了研究分析。结果显示,在分类地位上OH99株归属于O型FMDV,与OTY TW/97具有较高的同源性,而与其他参考毒株的差异性比较大,而且在基因组功能未知区域和3A编码区域具有两处明显的基因片段缺失现象,其中3A编码区缺失30nt,与OTY TW/97株相同,但功能未知区域的缺失状况与OTY TW/97稍有差异。根据VP1基因序列,对OH99株与参考毒株进行了系统发生树分析,分析结果表明OH99株与OTY TW/97株在同一基因型内,其遗传关系最近,而与其毒株遗传关系较远。 展开更多
关键词 fmdv OH99株 基因组 序列测定 特征 分子克隆 非编码区 结构蛋白 口蹄疫病毒
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用原位杂交对BHK-21细胞中的FMDV定位和检测 被引量:1
12
作者 邵军军 常惠芸 +3 位作者 林彤 丛国正 独军政 谢庆阁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第11期1170-1173,共4页
为了明确FMDV在细胞内的增殖部位,建立检测细胞内低拷贝FMDV的方法,对试验接种FMDV O/Akesu/58(107TCID50)毒株的BHK-21细胞中2~10 h不同时间段的病毒RNA进行检测和定位.选用FMDVRNA非结构蛋白区3D保守序列作为寡核苷酸探针,采用尾段... 为了明确FMDV在细胞内的增殖部位,建立检测细胞内低拷贝FMDV的方法,对试验接种FMDV O/Akesu/58(107TCID50)毒株的BHK-21细胞中2~10 h不同时间段的病毒RNA进行检测和定位.选用FMDVRNA非结构蛋白区3D保守序列作为寡核苷酸探针,采用尾段标记法以地高辛-11-dUTP标记,用原位杂交敏感加强型试剂盒检测杂交体.结果显示,从感染FMDV后2~10 h内的BHK-21细胞中检测出阳性染色的病毒粒子,这些病毒粒子大多集中在核周围,随感染时间延长阳性染色信号增强.这说明用寡核苷酸探针与敏感加强型试剂盒结合对检测细胞内低拷贝的病毒粒子是可行的,同时也从分子水平上证明FMDV主要在细胞质中进行复制和繁殖. 展开更多
关键词 原位杂交 fmdv 探针 BHK-21
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FMDV 3C蛋白酶基因的克隆及在昆虫细胞中的表达 被引量:1
13
作者 曹轶梅 卢曾军 +2 位作者 孙普 孙甲川 刘在新 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期312-316,共5页
口蹄疫病毒3C蛋白酶在病毒的致病机理、聚蛋白前体的加工和RNA的复制上起着很重要的作用,是当前抗病毒研究的一个重要靶点。本研究从AsiaⅠ型FMDV适应细胞毒中提取RNA,用RT-PCR技术扩增3C基因,首先克隆到pGEM-T载体,再亚克隆到杆状病毒... 口蹄疫病毒3C蛋白酶在病毒的致病机理、聚蛋白前体的加工和RNA的复制上起着很重要的作用,是当前抗病毒研究的一个重要靶点。本研究从AsiaⅠ型FMDV适应细胞毒中提取RNA,用RT-PCR技术扩增3C基因,首先克隆到pGEM-T载体,再亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB中,构建出重组转移载体pMel-3C。最后将含有目的基因的转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了重组杆状病毒。重组病毒经扩增后以10个MOI感染Sf9细胞,接种病毒72h后收获细胞,样品经SDS-PAGE和Westernblot证实3C蛋白获得表达,分子量约23kDa,与预测蛋白大小一致,且能被FMDV感染阳性血清所识别。本研究为空衣壳的体外组装及新型抗病毒药物设计的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 fmdv 3C蛋白酶基因 SF9细胞 杆状病毒 表达
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通过耐酸性改造在昆虫细胞中组装FMDV空衣壳结构 被引量:1
14
作者 曹轶梅 卢曾军 +3 位作者 孙甲川 孙普 郭建宏 刘在新 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期1069-1077,共9页
【目的】口蹄疫病毒(FMDV)对酸很敏感,当pH值低于7时,二十面体对称的衣壳结构就会裂解成12S的五聚体。而昆虫细胞培养基的正常pH值在6.3左右,很难应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中组装天然的FMDV空衣壳结构。本研究旨在通过耐酸性改造... 【目的】口蹄疫病毒(FMDV)对酸很敏感,当pH值低于7时,二十面体对称的衣壳结构就会裂解成12S的五聚体。而昆虫细胞培养基的正常pH值在6.3左右,很难应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中组装天然的FMDV空衣壳结构。本研究旨在通过耐酸性改造,应用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中组装产生AsiaⅠ型FMDV空衣壳结构。【方法】应用定点突变技术改变VP3上的H140和H143为亮氨酸,以提高空衣壳对酸的耐受性。将改造和未改造的P12A基因和3C基因插入带双启动子的杆状病毒转移载体pFastBacTM Dual中,通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒,转染Sf9细胞,获得两株表达FMDV全衣壳蛋白的重组杆状病毒BacmP12A3C和BacP12A3C。重组杆状病毒经增殖后感染High FiveTM细胞,进行目的蛋白的表达。【结果】通过Western blotting检测表明目的基因均获得表达,且衣壳蛋白被3C蛋白酶成功地加工裂解。双抗体夹心ELISA和免疫荧光检测结果表明表达蛋白主要集中在细胞膜上,且具有很好的抗原性。通过电镜观察到P12A基因改造的重组杆状病毒在昆虫细胞内产生了直径为25~30nm的空衣壳结构,而P12A基因未改造的重组杆状病毒观察到很多直径小得多的结构。【结论】本研究首次用电子显微镜在昆虫细胞中观察到FMDV完整的空衣壳结构,为基因工程亚单位疫苗和新型诊断试剂的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 fmdv 耐酸性改造 昆虫细胞 组装 空衣壳结构
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基于免疫层析试纸的猪O型FMDV抗体水平监测 被引量:1
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作者 卢清侠 杨继飞 +5 位作者 金前跃 杨苏珍 柴书军 万博 郝慧芳 张改平 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期558-561,567,共5页
为了应用免疫层析试纸评价猪口蹄疫O型合成肽疫苗的免疫效果,对50头试验仔猪进行免疫注射,并在首次免疫后28 d及2次免疫后20 d采血,通过试纸定量测定结果来监测试验猪抗体水平变化,同时对比猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试... 为了应用免疫层析试纸评价猪口蹄疫O型合成肽疫苗的免疫效果,对50头试验仔猪进行免疫注射,并在首次免疫后28 d及2次免疫后20 d采血,通过试纸定量测定结果来监测试验猪抗体水平变化,同时对比猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒的检测结果.结果表明,猪口蹄疫O型合成肽疫苗能快速诱导产生高水平的抗体,首次免疫抗体阳性率达88%,2次免疫抗体阳性率高达100%.试纸定量测定结果表明,2次免疫后猪群免疫抗体水平整体显著提升,并保持在较高水平.与ELISA试剂盒比较二者具有相同的敏感性和特异性,符合率为100%. 展开更多
关键词 fmdv 免疫抗体水平 免疫层析试纸 定量测定 ELISA
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用原位RT-PCR对BHK-21细胞中的FMDV检测和定位 被引量:1
16
作者 邵军军 常惠芸 +3 位作者 林彤 丛国正 独军政 谢庆阁 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第12期1086-1088,共3页
目的为了明确FMDV在BHK-21细胞中的复制和增殖部位,建立原位检测FMDV的方法。方法以地高辛标记的寡核苷酸作为探针,用间接原位RT-PCR技术对实验接种FMDV的BHK-21细胞中的FMDV RNA进行检测和定位。结果在接毒细胞的细胞质中有大量强阳性... 目的为了明确FMDV在BHK-21细胞中的复制和增殖部位,建立原位检测FMDV的方法。方法以地高辛标记的寡核苷酸作为探针,用间接原位RT-PCR技术对实验接种FMDV的BHK-21细胞中的FMDV RNA进行检测和定位。结果在接毒细胞的细胞质中有大量强阳性蓝染颗粒,阴性对照细胞中没有蓝染颗粒出现,也没有明显的背景染色。结论结果表明FMDV RNA在细胞的细胞质中进行复制和增殖,同时也表明原位RT-PCR是检测细胞内病毒的一种敏感、特异的方法。 展开更多
关键词 原位RT-PCR fmdv BHK-21细胞 原位杂交
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运用RT-PCR一步法和Nested-CR法快速检测FMDV的研究 被引量:2
17
作者 蒋正军 尹燕博 +11 位作者 龚振华 马洪超 孙淑芳 蔡丽娟 郭福生 李葳 吴时友 黄运生 林庆燕 丁有胜 骆德海 陈义民 《中国动物检疫》 CAS 1997年第2期3-5,共3页
将O、A型FMDVRNA分离纯化,用RT-PCR法扩增其聚合酶编码基因,可检测到A型10-6倍稀释、O型10-4倍稀释乳鼠肌肉毒。Nested-PCR扩增该基因内部片段,进一步说明该方法准确可靠。RT-PCR一步完成... 将O、A型FMDVRNA分离纯化,用RT-PCR法扩增其聚合酶编码基因,可检测到A型10-6倍稀释、O型10-4倍稀释乳鼠肌肉毒。Nested-PCR扩增该基因内部片段,进一步说明该方法准确可靠。RT-PCR一步完成使整个检测时间不超过12小时。 展开更多
关键词 口蹄疫 病毒 fmdv 聚合酶链反应
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牛FMDV受体整合素β6亚基LBD的多克隆抗体制备及初步应用 被引量:1
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作者 独军政 常惠芸 +3 位作者 高闪电 王景锋 赵建勇 才学鹏 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期696-698,共3页
目的:利用大肠杆菌表达牛FMDV受体整合素β6亚基的配体结合域(LBD)片段,纯化重组目的蛋白后制备兔多克隆抗体并对其进行初步应用。方法:以含有牛整合素β6亚基全长cDNA的质粒为模板PCR扩增得到β6LBD基因片段,与原核表达载体pGEX4T-1相... 目的:利用大肠杆菌表达牛FMDV受体整合素β6亚基的配体结合域(LBD)片段,纯化重组目的蛋白后制备兔多克隆抗体并对其进行初步应用。方法:以含有牛整合素β6亚基全长cDNA的质粒为模板PCR扩增得到β6LBD基因片段,与原核表达载体pGEX4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β6LBD,测序确认开放阅读框正确后,转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达重组牛β6LBD融合蛋白。SDS-PAGE和Westernblot鉴定后提取包涵体,电泳分离纯化重组融合蛋白,免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,以ELISA、琼脂扩散实验、免疫组化鉴定该抗体的效价和特异性。结果:重组牛β6LBD融合蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,重组蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量(Mr)约为45000。制备的兔多克隆抗体效价达1∶12800以上,该抗体可与牛舌上皮细胞中的抗原分子结合,具有很好的特异性。结论:实现了牛FMDV受体整合素β6亚基LBD的原核表达和抗体制备,为研究受体β6亚基在牛体内的分布及其在FMDV感染过程中的作用机制提供了工具。 展开更多
关键词 fmdv受体 β6LBD 多克隆抗体 免疫组化
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Expression of Recombinant Gene P1-2A3C of FMDV Asia I in Different Bombyx mori Varieties 被引量:1
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作者 张韵 张金卫 +5 位作者 易咏竹 李志勇 李江涛 鱼南洋 丁农 柳纪省 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2011年第10期1528-1530,共3页
[Objective] The aim was to investigate the expression level of recombinant gene P1-2A3C of FMDV Asia I in different Bombyx mori varieties,so as to screen out the B.mori varieties suitable for the foreign gene expressi... [Objective] The aim was to investigate the expression level of recombinant gene P1-2A3C of FMDV Asia I in different Bombyx mori varieties,so as to screen out the B.mori varieties suitable for the foreign gene expression.[Method] The recombinant B.mori baculovirus rBmNPV(P1-2A3C) are injected into pupae of original species and hybrids of B.mori respectively.Then,the expression of antigen is detected by ELISA method and compared.[Result] The expression level of P1-2A3C significantly differed in different B.mori varieties,in which,the hybrids of Qiufeng×TQ78 and Qiufeng×Sijiaojian could be considered as the effective bioreactors for high-level expression of foreign genes.[Conclusion] This study provided the basis for breeding special B.mori varieties which can highly express target protein of Asia I FMDV. 展开更多
关键词 Asia I fmdv P1-2A3C Bombyx mori varieties
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AsiaⅠ型FMDV全衣壳蛋白基因在昆虫细胞中的表达与免疫活性分析
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作者 曹轶梅 孙甲川 +3 位作者 卢曾军 孙普 郭建宏 刘在新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期83-88,共6页
将AsiaⅠ型FMDV全衣壳蛋白P12A基因插入到带有蜂毒溶血肽信号序列的杆状病毒转移载体pMel-Bac中,构建重组转移载体pMel-P12A。然后将含有目的基因的转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。以感染复数(MOI)10的... 将AsiaⅠ型FMDV全衣壳蛋白P12A基因插入到带有蜂毒溶血肽信号序列的杆状病毒转移载体pMel-Bac中,构建重组转移载体pMel-P12A。然后将含有目的基因的转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。以感染复数(MOI)10的重组病毒感染Sf9细胞,72 h后收获细胞,经Western blotting、间接免疫荧光检测,结果表明P12A基因在昆虫细胞中获得表达,相对分子质量约82 ku,与预测蛋白大小一致,且能被FMDV阳性血清所识别。免疫荧光检测表明表达蛋白主要集中在细胞膜部分。夹心ELISA检测结果表明一部分表达蛋白分泌至培养基中,而有一部分蛋白仍在细胞中未能分泌。表达蛋白加入等量佐剂乳化后免疫豚鼠,间接ELISA检测结果表明豚鼠免疫后15 d即产生了特异性FMDV抗体。本研究为空衣壳的体外组装及基因工程亚单位疫苗的研究进行了有益的探索。 展开更多
关键词 fmdv 衣壳蛋白基因P12A 杆状病毒 SF9细胞 表达
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