表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建

为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。

表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

A型塞内卡病毒(SVA)是近年来新流行的一种传染性病原,与口蹄疫病毒(FMDV)具有相似的基因组结构,所致临床症状也十分相似。为了研发一种新型的基因工程活载体疫苗,用于预防塞内卡病毒感染和口蹄疫,以SVA全长感染性克隆pSVA-GX01为基础,在SVA 2A与2B基因之间插入O型FMDV的VP1基因,经双酶切及测序鉴定,成功获得了重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O。将重组质粒转染BHK-21细胞,拯救获得重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O,间接免疫荧光试验鉴定显示,该重组病毒可在细胞中表达O型FMDV的VP1蛋白。对该重组病毒进行体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析表明,重组毒株和亲本毒株在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性,插入的FMDV VP1基因可在细胞传代过程中稳定存在6代。研究结果为开发以塞内卡病毒为载体构建表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组基因工程活载体疫苗提供了参考。

猪FMDV的VP1结构蛋白特异性抗体间接ELISA的建立

以纯化的FMDV-VP1融合蛋白为抗原,建立了猪口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白间接ELISA检测方法。抗原包被浓度为10μg·mL-1时,血清最佳稀释度为1∶40,通过测定30份FMDV阴性血清,确定了该方法的阳性判定标准。结果表明,该方法特异性强,重复性好;对216份送检猪血清用ELISA检测,阳性检出率为31.5%,阴性检出率为68.5%,与HA符合率为96.2%,表明建立的VP1结构蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。

重组伪狂犬病病毒TK^-/FMDV VP1的构建

以伪狂犬病病毒 (PRV)为载体表达其他病原体抗原蛋白是伪狂犬病疫苗研究的一个重要方向。本文以广东地方分离株 (以下简称YA)为亲本株 ,用PCR方法得到同源左右臂 ,然后将重组转移载体和PRVYA的基因组共转染 ,用BUDR筛选出了表达口蹄疫病毒 (Foot_and_MouthDiseaseVirus ,FMDV)结构蛋白VP1的TK_重组病毒 ,用PCR和SDS -PAGE的方法对VP1蛋白进行了初步鉴定 。

表达Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒VP1蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-Ⅰ)VP1蛋白的重组腺病毒,本实验采用RT-PCR方法扩增DHV-Ⅰ HP-1株VP1基因,克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,并将其电转化于含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183中,通过同源重组制备含有重组腺病毒的质粒。重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞,获得重组腺病毒(rAd-VP1)。间接免疫荧光和western blot鉴定结果显示,DHV-Ⅰ的VP1蛋白在重组腺病毒感染的AD293中获得表达。rAd-VP1的制备为鸭免疫实验效果评价奠定了基础。

鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1重组蛋白的免疫保护效果试验

将鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1基因原核表达工程菌(pET32a+Vp1,BL21(DE3)PlysS)对基因Vp1进行大量表达和纯化,得到鸭甲肝弱毒MY株Vp1重组蛋白作为抗原制备亚单位疫苗,免疫雏鸭,用间接ELISA检测方法对免疫后抗体生成水平进行监测,并通过动物攻毒试验评价免疫保护效果。结果显示:Vp1重组蛋白免疫家兔后血清检测琼扩效价≥1∶64,细胞中和试验效价为1/45;雏鸭免疫后抗体生成水平呈明显上升趋势,对攻毒起到了保护作用。首次揭示了DHAV-1结构蛋白Vp1刺激机体产生抗体使雏鸭获得保护的能力。

肠道病毒71VP1重组蛋白的纯化与鉴定

近年来,肠道病毒71引发的手足口病发病率在我国呈上升趋势,严重危害儿童健康.本研究利用已有的重组原核表达载体pET32a-VP1,在大肠杆菌BL21内诱导其表达VP1融合蛋白,使用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE结果表明重组蛋白表达且纯化浓度较高,可用于今后的EV71抗原表位筛选与抗EV71病毒疫苗开发研究.

口蹄疫病毒结构蛋白VP1生物信息学分析

VP1是组成口蹄疫病毒衣壳的重要蛋白,具有该病毒的主要抗原位点,其基因序列分析已被广泛用于分子流行病学调查研究。从GenBank数据库检索并下载我国上传的FMDV VP1基因序列36个,以贵州A型FMDV VP1为参考,对蛋白理化性质、二级结构、同源性等进行分析。结果显示VP1基因编码区长度为636bp,共编码212个氨基酸,含有α-螺旋、β-转角等丰富的二级结构。同源性分析表明我国FMDV VP1基因核苷酸相似性为50.3%~99.2%。

基于VP1重组蛋白的口蹄疫病毒O型间接ELISA检测技术

采用RT—PCR方法扩增0型口蹄疫病毒VP1基因片段，将其克隆于pET-32a。将重组质粒转化宿主菌Rosetta，经1．Ommol／LIPTG诱导，外源基因获高效表达。通过Western—blot以及ELISA试验证明，重组VP1蛋白与标准阳性血清发生反应。

口蹄疫病毒VP1蛋白在酵母中的表达及免疫原性分析

目的 :利用毕赤酵母表达系统表达牛O型口蹄疫外壳蛋白(FMDVVP1) ,并对表达的蛋白进行免疫原性鉴定。方法 :将FMDVvp1基因克隆到毕赤酵母Pichiapastoris分泌性表达载体pSuperY中 ,构建重组表达载体pSuperY/vp1,经测序证明vp1基因序列的正确性。将纯化的重组质粒经线性化酶切后 ,用电转化法将pSuperY/vp1导入毕赤酵母菌种SMD116 8H中。对表达产物用SDS PAGE和Westernblot进行分析 ,并用酵母表达的FMDVVP1蛋白免疫小鼠。结果 :以重组质粒pSuperY/vp1转化毕赤酵母菌后 ,能表达相对分子量 (Mr)为 6 6 0 0 0和4 30 0 0的FMDVVP1蛋白。动物免疫结果表明 ,FMDVVP1蛋白能诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答。结论 :在毕赤酵母中成功地表达FMDVVP1蛋白 。

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的原核表达、纯化及鉴定

【目的】通过原核表达及纯化获得A型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1,为建立A型FMDV的ELISA诊断方法及开发安全、高效、广谱的新型基因工程疫苗提供技术支持。【方法】以含A型FMDV VP1基因的重组质粒p MD18-T-A-VP1为模板,通过特异性引物扩增A型FMDV的VP1基因,构建表达质粒p ET-32a-VP1和p GEX-6p-1-VP1,然后转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白。【结果】诱导表达获得的VP1融合蛋白主要以包涵体形式存在,分别经His·Bind和GST·Bind柱层析纯化,SDS-PAGE分析结果表明融合蛋白纯度较高;Western blotting检测分析发现,VP1融合蛋白能与豚鼠抗A型FMDV阳性血清发生特异性结合,但不与豚鼠抗O型和Asia1型FMDV阳性血清反应。【结论】经原核表达及纯化获得的A型FMDV VP1融合蛋白具有良好的特异性和抗原性,可用于易感动物的免疫及血清抗体筛查。

AsiaⅠ口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法:用纯化的AsiaI型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白为抗原免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠,经过3次免疫后,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,用SDS-PAGE电泳、间接ELISA以及微量细胞中和试验对所获得的mAb的特异性进行鉴定。结果:成功获得3株能稳定传代并分泌抗AsiaImAb的杂交瘤细胞株,分别命名为:1B8、5E1、5E2,其分泌的mAb为IgG1(1B8)和IgG2a(5E1、5E2)亚类,他们均能特异性的识别VP1重组蛋白和AsiaI型全病毒,其腹水效价在1:105～1:106。微量细胞中和试验表明该mAb能很好地识别灭活的FMDV,中和效价达1:1024以上。交叉试验表明该mAb具有高度特异性,型间无交叉反应,证明所获得的mAb均完全针对AsiaI FMDV抗原决定簇。结论:在口蹄疫病毒mAb的研究中,VP1重组蛋白有望代替活病毒来制备mAb。AsiaI口蹄疫病毒VP1mAb的成功制备,为进一步研究和开发新型口蹄疫的检测方法和抗原表位奠定了基础。

表达GⅡ.4型诺如病毒VP1复制缺陷型腺病毒构建与鉴定

人诺如病毒(norovirus,NoV)在体外难以培养,不宜采用经典疫苗的方式进行疫苗研发,以腺病毒为载体的重组腺病毒疫苗为诺如病毒疫苗的研发提供另一种路线选择。构建表达人GⅡ.4型诺如病毒VP1蛋白的重组腺病毒为该技术路线的疫苗研发奠定基础。首先使用PCR扩增诺如病毒VP1片段,通过酶切、连接、转化,克隆含VP1基因的pshuttle-CMV-VP1穿梭质粒,再与腺病毒骨架质粒进行同源重组,重组质粒鉴定正确后使用PacⅠ酶切线性化,转染至HEK293细胞进行病毒包装,包装成复制缺陷型的完整腺病毒颗粒命名为rAd-VP1,病毒传代后进行滴度测定,并感染HEK293细胞,通过Western Blot方法鉴定重组腺病毒外源蛋白VP1的表达情况。结果表明,包装传代后的重组腺病毒浓缩后滴度达到CCID_(50)=5×10^(9)/mL,并且能在HEK293细胞成功表达VP1蛋白。研究为rAd-VP1的动物免疫评价和诺如病毒的疫苗研发提供基础。

重组腺病毒表达牛纽布病毒VP1蛋白及免疫效果评价

旨在构建一种表达牛纽布病毒(bovine nebovirus,BNeV)VP1蛋白的人5型复制缺陷型重组腺病毒rAd5-BNeV_VP1,并评价其免疫效果。以优化合成的BNeV VP1基因序列构建重组穿梭质粒pDC316-VP1,利用AdMax腺病毒包装系统包装重组腺病毒rAd5-BNeV_VP1,并在小鼠中评价其免疫效果。结果显示,通过比对国内BNeV VP1氨基酸序列,根据HEK293细胞密码子偏嗜性优化合成国内流行毒株Bo/LN-13/18/CH株的BNeV VP1序列,序列大小为1650 bp。将pDC316-VP1与骨架载体pBHGIox_E1,3Cre共转染入HEK293细胞包装出重组腺病毒rAd5-BNeV_VP1。RT-PCR扩增出1650 bp的BNeV VP1基因条带,Western blot及间接免疫荧光反应证实rAd5-BNeV_VP1能够成功表达VP1蛋白,蛋白大小约为57.5 kDa,表明成功包装出rAd5-BNeV_VP1且VP1基因能在重组腺病毒中稳定表达,其TCID_(50)为10-5.34/0.1 mL。通过肌肉注射和滴鼻2种途径免疫小鼠均能产生较高的特异性抗体水平,二免7 d后肌肉注射组抗体效价最高可达1∶105,滴鼻组抗体效价最高可达1∶104;滴鼻组可产生高于PBS组2倍的INF-γ和IL-2(P<0.05)。结果表明,本研究构建表达BNeV VP1蛋白的重组腺病毒rAd5-BNeV_VP1具有良好的免疫原性,可刺激小鼠快速产生针对BNeV VP1的特异性抗体,为今后BNeV疫苗的研发奠定了基础。

建立一种用重组蛋白检测抗口蹄疫病毒抗体的间接ELISA方法

目的研究以重组蛋白作为包被抗原检测口蹄疫病毒(FMDV)感染后的动物血清中特异性抗体的可能性,为建立一种非病毒颗粒的ELISA检测试剂盒提供实验依据。方法利用自行构建表达的O型口蹄疫病毒VP1表位肽重组蛋白(VP1epi)作为包被抗原,采用间接ELISA方法确定抗原的最佳工作浓度和包被方法,优化各项实验条件,并以FMDV感染后的豚鼠血清作为标准阳性血清确定ELISA方法的特异性和灵敏度。结果FMDV感染后的阳性豚鼠血清可以很好地识别VP1epi重组蛋白,用此蛋白包被检测抗FMDV抗体的灵敏度可达1∶3200,并证明所检测的抗体是FMDV特异性的。结论VP1epi重组蛋白可以替代FMDV颗粒用于建立检测抗FMDV抗体的ELISA试剂盒。

甜菜夜蛾核型多角体病毒vp39基因重组真核表达质粒的构建及鉴定

利用DNA重组技术 ,将杆状病毒极早期基因ie1启动子基因克隆至重组质粒pGEM Se39中 ,成功地构建了重组真核表达质粒pGEM IE1 Se39.

表达PCV-2 Cap和PPV-1 VP2蛋白的重组PRV的构建及鉴定

为了构建表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白和猪细小病毒1型(PPV-1)VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒(PRV)及鉴定其免疫原性,试验采用经典同源重组技术构建重组病毒,利用密码子优化的VP2基因(VP2_(opti))和含PRV gG蛋白信号肽序列的VP2_(opti)基因分别构建重组质粒pMD18T-LR(TK)-VP2_(opti)和pMD18T-LR(TK)-VP2_(opti)(SP)。用已构建的重组病毒rPRV-TK^-/gE^-/gG^-/3Cap^+为骨架,以EGFP为标签经同源重组获得重组病毒。采用IPMA法鉴定Cap蛋白和VP2蛋白抗原在重组病毒感染的PK-15细胞中的表达,采用IFA法鉴定VP2蛋白在重组病毒感染的PK-15细胞中的表达与定位。用这2株重组病毒免疫小鼠,通过检测血清中PRV、PCV-2和PPV-1抗体水平对构建的重组病毒在小鼠体内的免疫原性进行评价。结果表明:经同源重组获得重组病毒rPRV-TK^-/VP2^+/gE^-/gG^-/2Cap^+和rPRV-TK^-/VP2^+(SP)/gE^-/gG^-/2Cap^+;在重组病毒感染的PK-15细胞中均能检测到阳性Cap蛋白和VP2蛋白抗原;重组病毒rPRV-TK^-/VP2^+/gE^-/gG^-/2Cap^+表达的VP2蛋白定位于细胞浆和细胞核,而重组病毒rPRV-TK^-/VP2^+(SP)/gE^-/gG^-/2Cap^+表达的VP2蛋白定位于细胞浆;用这2株重组病毒免疫小鼠能够检测到PRV中和抗体;用灭活的重组病毒免疫小鼠后可产生低水平的Cap和VP2抗体,而重组病毒活毒免疫的小鼠未检测到相应抗体。说明这2株重组病毒在体外能够表达Cap蛋白和VP2蛋白,PRV gG蛋白信号肽序列的加入促进了VP2蛋白从细胞核的释放。

衣原体GPIC噬菌体衣壳蛋白Vp1的克隆、表达和鉴定

目的获得衣原体GPIC噬菌体衣壳蛋白Vp1基因及其蛋白。方法提取噬菌体ΦCPG1及其核酸,并对Vp1克隆、表达,鉴定。结果所获得的Vp1基因片段经测序,长度为1 661 bp,检索确认其序列与Genebank一致。对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE和蛋白质印迹均显示获得相对分子质量约62 000的衣原体GPIC噬菌体衣壳蛋白Vp1。结论成功获得了噬菌体衣壳蛋白Vp1,为进一步研究打下基础。

口蹄疫病毒O型病毒VP1蛋白表达及鉴定

利用大肠杆菌p ET-30a表达系统表达口蹄疫病毒(FMD)O型野毒株完整的VP1蛋白,并以Western blot试验进行鉴定。结果表明:VP1蛋白以可溶性表达,大小约为25 ku,可与标准O型口蹄疫病毒阳性血清特异结合。由此说明,口蹄疫病毒VP1原核表达蛋白有良好的反应原性,为构建口蹄疫病毒病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)和快速特异诊断试剂研制奠定基础。

禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

对AEV陕西分离株VP1基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物;以纯化的蛋白为包被抗原建立ELISA方法,并对反应条件进行优化。结果表明,VP1蛋白在大肠杆菌中成功表达,产物约为50 000的融合蛋白,具有良好的反应原性;优化的ELISA最佳工作条件为:重组抗原包被质量浓度3.8mg/L,37℃2h后4℃过夜,1%BSA 37℃封闭2h,待检血清1∶50稀释37℃孵育0.5h,酶标抗体1∶4 000稀释,37℃作用30min,底物37℃显色5min,临界值为0.360;建立的ELISA方法特异性强、重复性好、敏感性高;临床检测180份样品,与美国IDEXX公司AEV抗体检测试剂盒检测结果符合率为91.9%。该方法可用于临床样品的大批量检测。