口蹄疫病毒样颗粒研究进展

病毒样颗粒(VLP)具有与真实病毒粒子大小相似的结构,能引起免疫应答但不具有感染性。口蹄疫病毒是无囊膜的RNA病毒,其结构蛋白可组装成VLP,且具有良好的免疫原性。本文对口蹄疫病毒VLP的免疫机制、表达系统及应用、口蹄疫病毒VLP作为抗原在诊断和疫苗中的应用进行了综述。

口蹄疫病毒样颗粒作为抗癌药物载体的条件探索

[目的]探讨口蹄疫病毒样颗粒作为抗癌药物载体运载药物进入细胞的可行性。[方法]利用原核表达系统表达纯化口蹄疫结构蛋白,在组装缓冲液中形成口蹄疫病毒样颗粒,利用化学偶联试剂将抗癌药物偶联到病毒样颗粒的表面,形成的载体药物复合物处理细胞,荧光染色观察复合物进入细胞情况。[结果]口蹄疫病毒样颗粒作为新型抗癌药物载体,能够有效携带抗癌药物,该研究为设计新型药物载体提供了可能。[结论]口蹄疫病毒样颗粒具有作为新型药物载体的潜力。

病毒样颗粒作为口蹄疫病毒抗原表位载体的研究进展

病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)不含有病毒核酸,不具有自我复制的能力,但拥有与完整病毒粒子相似的空间结构和免疫原性,可以作为口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)抗原表位的载体,将其展示在它的表面。主要介绍了作为FMDV抗原表位的VLPs载体:FMDV-VLPs、HBc-VLPs、PCV2-VLPs和PPV-VLPs,并阐述了VLPs在几种表达系统中的组装现状,以期为今后有关FMD的VLPs研究提供参考。

兔抗O型口蹄疫VLPs酶标抗体的制备及初步应用

为制备兔抗O型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)的酶标抗体,进一步建立O型口蹄疫病毒的ELISA检测方法,通过原核表达、体外纯化和组装O型口蹄疫VLPs,免疫家兔制备兔抗O型口蹄疫VLPs高免血清,并采用亲和层析法纯化IgG,改良过碘酸钠法制备兔抗O型口蹄疫VLPs的酶标抗体(rabbit anti-type O foot-and-mouth disease IgG-HRP)。结果显示,兔抗O型口蹄疫VLPs高免血清效价达1∶4 096,纯化后的IgG纯度达90%,效价达1∶512 000。表明获得了高纯度的兔抗O型口蹄疫VLP的酶标抗体,可用于O型口蹄疫的ELISA检测。

猪O型口蹄疫病毒样颗粒的构建及鉴定

为开发猪O型口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒(VLPs)基因工程亚单位疫苗,试验参考GenBank中登录的FMDV毒株基因序列(登录号:JN998085),设计针对VP 1、VP 2、VP 3和VP 44个基因片段的特异性引物,以O型FMDV O/MYA98/XJ/2010毒株的cDNA序列为模板,对目的基因进行PCR扩增;将获得的VP 3、VP 1和VP 4、VP 2基因片段分别插入2个杆状病毒供体质粒(pFastBacDual)的p10和pH双元启动子中,构建pFBD-VP3-VP1和pFBD-VP4-VP22个重组转座质粒;将验证正确的2个重组转座质粒分别转化含有穿梭载体(Bacmid)的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得2个重组杆粒rBacmid-VP3-VP1和rBacmid-VP4-VP2,经验证正确后,对其进行扩增和提取,将其分别转染Sf9贴壁昆虫细胞,构建2个重组杆状病毒rvAc-VP3-VP1和rvAc-VP4-VP2;2个重组杆状病毒共同感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞,利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞内对4个基因进行表达,目的蛋白通过间接免疫荧光试验(IFA)、SDS-PAGE、Western blotting及透射电镜(EM)进行检测。结果显示,本研究成功构建2株分别表达FMDV VP1、VP2、VP3和VP44个结构蛋白的重组杆状病毒;特异性抗体检测发现,4个蛋白VP1~VP4均成功表达,且具有良好的特异性反应;4个蛋白在Sf9昆虫细胞内能够完成自我组装,形成与天然病毒结构相似的VLPs,直径大小在25~30 nm。本研究利用共感染表达方式在Sf9昆虫细胞内成功制备出FMDV病毒颗粒,为开发高效安全的FMDV基因工程亚单位疫苗开辟了一条新思路。

不同粒径口蹄疫病毒样颗粒-ZIF-8复合物诱导小鼠的体液免疫效果分析

为进一步提高口蹄疫(foot-and-mouthdisease,FMD)病毒样颗粒(virus-likeparticles,VLPs)疫苗的免疫效果,本研究采用仿生矿化方法,将Zn2+和2-甲基咪唑按照不同浓度配比制备了不同粒径的FMDV VLPs-沸石咪唑骨架-8(zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8)复合物,以探究尺寸效应对免疫效果的影响。结果显示,成功制备出3种不同粒径的FMDV VLPs-ZIF-8,粒径分别约为70、100、1000 nm。细胞毒性和组织病理学试验表明,3种复合物均具有良好的生物安全性。小鼠免疫试验表明,3种复合物均能明显提高中和抗体和特异性抗体水平,并且随着复合物体积的减小,其免疫效果也随之增强。本研究表明,ZIF-8包封FMDV VLPs可显著增强其免疫效果,且具有尺寸依赖性。

口蹄疫病毒病毒样颗粒疫苗的研究进展

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种烈性传染病,主要感染牛、猪、绵羊、山羊等偶蹄动物,我国将其列为一类传染病,注射疫苗是控制该疾病的有效措施。病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的形态结构与天然病毒高度相似,且不含病毒核酸,具有与完整病毒粒子相似的免疫原性,可有效诱导机体产生免疫应答,许多抗原可通过基因工程的方法在VLPs表面展示。FMDV的衣壳蛋白可自组装成VLPs,是一种理想的疫苗。本文主要对FMDV VLPs及其表达系统的研究进展作一综述。

Poly(I∶C)增强口蹄疫病毒样颗粒疫苗免疫效果的研究

口蹄疫是一种高度接触性传染病,严重影响着畜牧业的健康发展。目前主要通过接种疫苗对其进行预防。近年来,病毒样颗粒(virus-like partic,lVeLsPs)疫苗由于具有天然病毒相似的结构、不含有病毒的遗传物质、易被免疫细胞识别等优点,逐渐成为研究的热点。为了进一步提高口蹄疫VLPs疫苗的免疫效果,本研究选取poly(I∶C)联合ISA 201共同使用,以探究poly(I∶C)对口蹄疫VLPs疫苗免疫效果的影响。结果,poly(I∶C)可以刺激机体产生更高水平的特异性抗体和中和抗体以及IF N-γ、T NF-α和IL-4等细胞因子的分泌,从而引起机体产生更强的体液免疫应答和细胞免疫应答,进而保护动物机体免受口蹄疫病毒的攻击。

口蹄疫病毒样颗粒诱导表达型载体的构建及其BHK-21细胞池的筛获

瞬时表达是目前利用哺乳动物细胞表达口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白的主流方法。为实现染色体稳定表达FMDV衣壳蛋白并高效组装出病毒样颗粒(virus like particles,VLPs),本研究构建了piggy Bac(PB)转座-组成型表达、PB转座-四环素(tetracycline,Tet)诱导型表达两套质粒。利用荧光蛋白标记技术,验证了质粒的功能。通过抗生素筛选得到了组成型表达P12A3C(WT/L127P)基因的BHK-21细胞池(C-WT、C-L127P)和诱导型表达P12A3C(WT/L127P)基因的BHK-21细胞池(I-WT、I-L127P)。荧光观察和PCR检测证明了绿色荧光蛋白、3C蛋白酶、反向四环素转录激活因子等基因的稳定整合。Western blotting、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验证明了细胞池I-L127P具有更强的衣壳蛋白和VLPs生产能力。本研究首次实现了哺乳动物细胞染色体诱导表达FMDV衣壳蛋白,有助于推动哺乳动物生产FMDV VLPs疫苗的技术工艺,也为构建其他蛋白的哺乳动物细胞诱导型表达系统提供了参考。

壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs免疫豚鼠的免疫增强作用

为了探索壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的免疫增强作用,本研究利用O型口蹄疫病毒(FMDV)的病毒样颗粒作为抗原,通过Chitosan A或者加入白油后制成的混合乳Chitosan B两种壳聚糖凝胶微球与VLPs配伍免疫豚鼠,免疫后测定被免疫豚鼠的T淋巴细胞增殖情况,检测FMDV特异性抗体水平,观察计算攻毒后保护率。结果,壳聚糖季铵盐凝乳胶微球能够诱导豚鼠产生高水平的FMDV特异性抗体,T淋巴细胞增殖效果高于ISA201佐剂。此外,Chitosan B佐剂组优于Chitosan A佐剂组。上述结果说明,壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型FMD VLPs具有免疫增强作用,可以诱导VLPs的体液免疫和细胞免疫应答;壳聚糖季铵盐凝乳胶微球是一种具有潜力的疫苗佐剂,可以成为FMDV疫苗的候选佐剂。

含FMDV中和表位的重组病毒颗粒的构建及鉴定

针对FMDV的疫苗研究一直是防控口蹄疫的重点,而病毒样颗粒（VLPs）形式的疫苗因其安全性和近似传统灭活疫苗的良好免疫效果,近年来逐渐成为疫苗研究的一个新方向.本实验利用猪圆环病毒PCV2的衣壳蛋白（CAP）作为载体,分别插入FMDV MYA98毒株的抗原表位组合——VP1蛋白上B细胞表位141～160aa（B）与串联的B细胞和T细胞表位141～160aa-21～40aa-141～160aa（BTB）,构建对应重组杆状病毒,分别命名为reBAC-CAP-B,reBAC-CAP-BTB.将上述病毒颗粒转入Sf9细胞表达,收获重组杆状病毒并再次感染Sf9细胞扩大病毒滴度,获得目的蛋白CAP-B,CAP-BTB,经过SDS-PAGE,Western blot鉴定正确,透射电镜观察到20～30nm大小的目的颗粒.