鲤NADH泛醌氧化还原酶亚基3基因的克隆及低温适应相关性分析

根据鲤低温下特异表达的基因(片段)序列设计引物,采用2轮菌落PCR方法对鲤脑全长cDNA文库中的克隆进行筛选,确定了基因序列152在文库中的位置,经生物信息学比对分析确定其为NADH泛醌氧化还原酶亚基3基因.这一基因在低温下的特异表达,对于低温下鱼类机体的供能,起着重要作用.结果还表明,NADH泛醌氧化还原酶亚基3基因在鲤氧化呼吸链电子传递系统中与低温适应性状在一定程度上存在相关性.

褐飞虱NADH泛醌氧化还原酶51kD亚基全长cDNA序列的克隆及分析

利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆了褐飞虱NADH泛醌氧化还原酶51kD亚基(NQO)基因的全长cDNA片段,并进行了核苷酸序列测定。结果表明,该cDNA片段长度为1 930 bp,所编码的蛋白与家牛、小家鼠、食蟹猴、人和蟾蜍的NADH泛醌氧化还原酶51kD亚基的氨基酸序列的同源性分别达到77%、76%、76%、75%和75%。Southern杂交分析表明,NQO基因在褐飞虱基因组中以单拷贝形式存在。

褐飞虱NADH泛醌氧化还原酶51kDa亚基cDNA片段的克隆及表达分析

NADH泛醌氧化还原酶是动物体内呼吸链电子传递系统的第一个酶,克隆水稻害虫褐飞虱的NADH泛醌氧化还原酶基因,及研究其在褐飞虱与水稻互作中的表达变化,将为科学防治褐飞虱提供新的线索。利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术克隆了褐飞虱NADH泛醌氧化还原酶51 kDa亚基基因的cDNA片段,并进行了序列测定;使用Northern杂交技术检测了该基因对两种不同抗性水稻的分子反应。分子杂交结果表明,在取食抗性水稻品种B5后,褐飞虱的NADH泛醌氧化还原酶51 kDa亚基基因表达水平明显升高,而取食感虫水稻TN1后,该基因的表达水平没有明显变化。

捻转血矛线虫NADH:泛醌氧化还原酶结构域包含蛋白基因的克隆表达及功能分析

选取捻转血矛线虫NADH:泛醌氧化还原酶结构域包含蛋白(NDUDC)基因进行克隆表达,并对其功能进行研究。采用RT-PCR方法对NDUDC基因进行克隆,构建表达载体得到重组蛋白质,Western blot分析蛋白质的抗原特性;采血分离山羊外周血单个核细胞(PBMCs)与重组蛋白质共培养,利用间接免疫荧光试验检验重组蛋白质与细胞的结合情况;以不同质量浓度(0、10、20、40μg·mL-1)重组蛋白质刺激细胞,测定其对细胞增殖、细胞迁移和NO分泌的影响。结果表明,重组蛋白质能够有效刺激细胞增殖,显著提高细胞迁移能力以及增加NO的分泌。可见NDUDC蛋白具有较强的抗原性,可刺激细胞发挥免疫功能。

NADH:泛醌氧化还原酶复合体组装因子2在肝癌组织中的异常表达和功能探讨

目的:基于肿瘤基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库的多组学数据,分析线粒体呼吸链复合体I组装因子NADH∶泛醌氧化还原酶复合体组装因子2(NADH∶ubiquinone oxidoreductase complex assembly factor 2,NDUFAF2)基因在肝癌组织中的表达、临床及预后意义,并探讨其参与肝癌发生发展的可能机制。方法:利用TCGA肝癌样本的RNA测序、全外显子组测序、单核苷酸多态芯片和DNA甲基化测序数据,分析NDUFAF2在肝癌中的表达特征及其异常高表达的可能机制。基于TCGA肝癌RNA测序数据获得与NDUFAF2高度相关性的共表达基因,进行Reactome、MSigDB通路和人类表型富集分析,并利用Cytoscape软件绘制功能网络。结果:对TCGA肝癌RNA测序数据的表达和生存分析显示,线粒体呼吸链复合体的全部亚基中,仅NDUFAF2在肝癌组织中显著高表达,且与不良的总生存率和无复发生存率均相关。肝癌组织中NDUFAF2的高表达与性别、人种、肿瘤分化程度和微血管侵犯显著相关(P均<0.05)。基因扩增和肝癌驱动基因TP53和CTNNB1的突变,以及MYC扩增是造成NDUFAF2高表达的可能原因。对肝癌组织中与NDUFAF2共表达的411个基因的富集分析显示,NDUFAF2可能通过调控细胞能量产生、氧化应激、RNA加工、蛋白翻译和c-Myc、mTORC1相关信号传导通路,促进肝癌的发生发展。结论:NDUFAF2在肝癌组织中的高表达可能通过调控RNA加工和蛋白翻译等生物学通路参与细胞癌变,可作为潜在的肝癌预后预测标志物和新的治疗干预靶点。

食管癌表达上调基因NADH氧化还原酶MLRQ亚基的研究及临床意义

目的研究在食管癌中差异表达明显的NADH氧化还原酶MLRQ亚基基因在食管癌中的表达,并探讨它在食管癌发生发展过程中的可能机制。方法利用微陈列技术方法获得一个在食管癌中的表达显著上调的NADH氧化还原酶MLRQ亚基基因,用RT PCR及Northern印迹从mRNA水平检测其在38对食管癌、7对贲门癌、14对胃癌、11对结肠癌和7对肝癌等消化系统肿瘤中的表达情况。结果(1)MLRQ基因在食管癌、贲门癌、胃癌、结肠癌和肝癌中显著上调者,分别为81.6%(31/38)、57.1%(4/7)、85.7%(12/14)、65.6%(7/11)、57.1%(4/7)。用X2检验,各组之间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)在38对食管癌配对组织中,MLRQ基因上调与临床分期、肿瘤浸润程度、淋巴结转移及分化程度无相关性(均P>0.05)。结论MLRQ亚基基因在消化道肿瘤中表达上调。

纳米金颗粒/麦尔多拉蓝溶胶的合成及NADH传感器应用

1引言 脱氢酶是氧化还原酶中为数最多的一类酶,目前已知超过300种脱氢酶使用氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）作为辅酶。在这些酶和辅酶协同作用催化底物时,NAD＋从底物接受电子被还原成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）。

抗氧化基因过表达提高运动发酵单胞菌糠醛耐受性

糠醛是木质纤维素水解液的主要抑制物,能诱发活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)产生。探索抗氧化基因对于糠醛耐受性的影响有助于改善菌株表型。过表达运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis自身的NADH氧化酶(ZMO1885)、NADP+还原酶(ZMO1753)和谷胱甘肽还原酶(ZMO1211)基因,检测胞内ROS、NADH/NAD+以及其耐受性能。结果表明,在2g/L糠醛条件下,相比对照菌株,ZM4/ZMO1885的胞内ROS降低了52.1%,生物量提高了38.9%,且未引起胞内辅因子扰动。过表达ZMO1753和ZMO1211没有显著提高菌株耐受性。在模拟木质纤维素水解液中,ZM4/ZMO1885的生物量较对照菌株提高了46.9%,糖耗速率提高了110.3%,乙醇生产力提高了195.2%。综上,过表达抗氧化酶基因能够影响糠醛胁迫耐受性,其中过表达ZMO1885不仅不影响细胞正常生长,还能降低ROS水平,提高糠醛去除率,改善了细胞的糠醛耐受性。

NAD(P)H:醌氧化还原酶基因多态性与阿尔茨海默病遗传易感性的关系

目的 探讨NAD(P)H :醌氧化还原酶 (NQO1)基因C6 0 9T位点基因多态性与散发性阿尔茨海默病 (SAD)遗传易感性的关系。 方法 应用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)方法检测了 12 0例SAD患者和 12 2名健康老年人的NQO1基因多态性分布特征。 结果 SAD组C等位基因频率低于对照组 ,SAD组为 45 0 % ,对照组为 5 7 0 % (OR =0 6 3,P <0 0 5 )。SAD组C/C基因型频率明显低于对照组 ,SAD组为 12 5 % ,对照组为 2 9 5 % (OR =0 34 ,P <0 0 1)。 结论 NQO1基因多态性与SAD发病明显关联 ,NQO1基因 6 0 9序列C/C基因型、C等位基因与SAD发病呈明显负关联。NQO1基因 6 0 9序列C等位基因对SAD发病可能有保护作用。

线粒体呼吸链膜蛋白复合体的结构

线粒体作为真核细胞的重要"能量工厂",是细胞进行呼吸作用的场所,呼吸作用包括柠檬酸循环和氧化磷酸化两个过程,其中氧化磷酸化过程的电子传递链(又称线粒体呼吸链)位于线粒体内膜上,由四个相对分子质量很大的跨膜蛋白复合体(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、和Ⅳ)、介于Ⅰ/Ⅱ与Ⅲ之间的泛醌以及介于Ⅲ与Ⅳ之间的细胞色素c共同组成。线粒体呼吸链的功能是进行生物氧化,并与称之为复合物V的ATP合成酶(磷酸化过程)相偶联,共同完成氧化磷酸化过程,并生产能量分子ATP。线粒体呼吸链的结构生物学研究对于彻底了解电子传递和能量转化的机理是至关重要的,本文分别论述线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的结构,并跟踪线粒体呼吸链超复合体的结构研究进展。

野桑蚕线粒体ND5基因及其两端侧翼tRNA基因的克隆与序列分析

应用PCR技术,对中国山东青州野桑蚕mtDNA的ND5基因及其两端侧翼区域进行了克隆和序列分析。结果表明,在所测定的2．2kb左右的片段中,含有ND5基因的完整序列及Phe-tRNA(UUC)、Ser-tRNA(AGC)、Glu- tRNA(GAA)、His-tRNA(CAC)等4个tRNA基因,该片段的基因组结构与家蚕及其它地域来源野桑蚕的基因组结构基本一致,显示蚕类线粒体基因排列的保守性。ND5结构基因在不同家蚕及野桑蚕之间的比对分析表明,它们在核苷酸水平、氨基酸水平的同源性很高,相似性达96%以上。4个tRNA基因的碱基错配率较高,TψC环缺乏相对保守的T-ψ-C-Pu-A序列,各臂的碱基配对数、各环碱基数目变化较大。以ND5基因的核苷酸序列及氨基酸残基序列进行了家蚕及野桑蚕的分子进化分析,进一步证明家蚕起源于中国野桑蚕。

宫颈鳞癌组织中NRDR选择性剪接新亚型的鉴定及意义

目的:探讨NRDR选择性剪接新亚型NRDRB1 mRNA和蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达及其临床意义。方法:采用RT-PCR、免疫荧光、免疫沉淀、免疫印迹、MALDI-TOF质谱分析等技术,检测正常宫颈上皮及宫颈鳞癌组织中NRDRB1mRNA及蛋白表达。结果:NRDRB1亚型全长1 171 bp,其蛋白保留了SDR家族的N末端辅酶结合模序、C末端底物结合模序以及过氧化物酶体定位信号。因第3外显子的缺失,导致SDR家族典型的“LVSNAA”折叠的丢失,使NRDRB1蛋白空间构象发生改变,从而影响该蛋白的细胞内定位和功能,NRDRB1蛋白的亚细胞定位明显不同于NRDR,酶活性亦明显低于NRDR。NRDRB1 mRNA及蛋白在宫颈鳞癌组织中表达(15/27,55.6%),明显高于正常宫颈上皮组织(P<0.05),正常宫颈上皮除NRDR外,未检测到NRDRB1 mRNA及其蛋白。结论:NRDR选择性剪接的异常,以及新的剪接亚型NRDRB1细胞内定位及蛋白酶活性的改变可能与宫颈鳞癌的发生发展密切相关。

SIOC-AA-005的抗肿瘤作用机制研究

探讨SIOC—AA-005抗肿瘤的作用机制．采用测定HT-29细胞线粒体膜流动性、线粒体 ATP含量、线粒体ATP酶活性及NADH-CoQ氧化还原酶活性、细胞质膜NADH氧化酶活性的方法,对 其作用机制进行了深入探讨;SIOC—AA-005在10 nmol／L剂量下可明显降低线粒体膜的流动性,并 使线粒体膜电位显著升高;在此浓度下,SIOC-AA-005还可使HT-29细胞内的ATP耗竭,ATP酶活 性受到抑制,线粒体中能量产生过程受阻．在胞外反应体系中,SIOC-AA-005对NADH-CoQ氧化还 原酶有强烈的抑制作用,对细胞质膜NADH氧化酶也具有较强的抑制作用．SIOC-AA-005可能是通 过抑制线粒体NADH-CoQ氧化还原酶、抑制细胞质膜NADH氧化酶以及线粒体ATP酶活性,从而使 线粒体膜流动性下降,膜电位升高,细胞内ATP耗竭,最终使肿瘤细胞死亡．

NQO1基因多态性与阿尔茨海默病的相关研究

目的:探讨NAD(P)H:醌氧化还原酶(NQO1)基因C609T位点多态性与散发性阿尔茨海默病(AD)遗传易感性的关系。方法:应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测了135例AD患者和138例健康老年人的NQO1基因多态性分布特征。结果:AD组C等位基因频率低于对照组,AD组为44.8%,对照组为55.8%(OR=0.64,P<0.05)。AD组C/C基因型频率明显低于对照组,AD组为12.6%,对照组为29.0%(OR=0.35,P<0.001)。结论:NQO1基因多态性与散发性AD发病明显关联,NQO1基因609序列C/C基因型、C等位基因与散发性AD发病呈明显负关联。NQO1基因609序列C等位基因对散发性AD发病可能有保护作用。

GRIM-19与STAT3蛋白作用及相关机制研究进展

线粒体在细胞生理当中起非常重要的作用,为主要供能器官,其在能量生成、应激、ROS生成方面起到了非常重要的作用,同时也在细胞凋亡方面扮演了重要角色.其中,线粒体NADH complex Ⅰ是电子传递链第1步,随着NADH氧化成NAD＋,伴随着质子穿越线粒体内膜,氧化还原辅助因子激活.研究显示,NADH：泛酮氧化还原酶（complex Ⅰ）共有45个亚单位,7个由线粒体DNA编码,其余由核编码基因编码,从胞质输送到线粒体.原核生物线粒体com-plex Ⅰ系统由13～14个亚基组成,这些亚基在真核生物中得到了保留,并且进化出氧化还原辅助因子[1].线粒体complex Ⅰ呈L型,其有2个臂,一个位于脂双层,另一个因含有更多亲水集团,突出于胞膜,且可以和胞膜分离,产生亚单位.其中GRIM-19是complex Ⅰ亚单位中的一员,是已知的氧化还原辅助因子[4].GRIM-19在细胞生长、凋亡以及维系线粒体复合物Ⅰ功能方面起到了非常重要的作用,并在近期得到了广泛研究.

山茱萸对糖尿病心肌病大鼠的干预作用及机制

目的探讨山茱萸对糖尿病心肌病大鼠的干预作用及机制。方法采用腹腔注射链脲佐菌素方法构建糖尿病大鼠模型。将50只Sprague-Dawley大鼠随机分为正常对照组（N组）、糖尿病组（D组）、山茱萸低剂量组（FC-L组,400mg/kg）、山茱萸高剂量组（FC-H组,800mg/kg）及氟伐他汀组（Flu组）,每组10只。12周后测体质量并计算心体比（H/B）和左心室质量指数（LVMI）。应用流式细胞仪检测心肌组织中活性氧（ROS）的表达,生化法检测大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）活性和心肌细胞中谷胱甘肽（GSH）含量,Western blot及real time PCR检测心肌组织中p-Akt蛋白及P22phox、p47phox、FN、ColⅢ和核因子-κB（NF-κB）mRNA表达。结果与对照组相比,模型组H/B、LVMI、ROS及P22phox、p47phox、FN、ColⅢ、NF-κB和p-Akt表达均显著升高（F=295.274～543.871,P〈0.05）,血清SOD、GSH-px和心肌细胞中的GSH含量均显著降低（F=325.274～415.287,P〈0.05）。山茱萸及氟伐他汀干预后,Flu组、FC-L组和FC-H组大鼠的心肌H/B、LVMI、ROS、P22phox、p47phox、FN、ColⅢ、NF-κB和p-Akt表达均显著低于模型组（F=112.557～478.684,P〈0.05）,血清SOD、GSH-px和心肌细胞中GSH含量显著升高（F=198.547～347.574,P〈0.05）,且均呈剂量依赖性。结论山茱萸干预可以减轻糖尿病大鼠心肌病变,可能与减少心肌组织氧化应激水平,下调NADPH氧化酶P22phox和p47Phox亚基与p-Akt表达有关。

ACTN4通过靶向NDUFV1对食管鳞状细胞癌的细胞增殖的影响

目的探究α-辅肌动蛋白-4(ACTN4)在食管鳞状细胞癌(ESCC)中的表达情况及其对ESCC细胞增殖的影响。方法采用免疫组化实验检测ESCC组织及配对正常组织中ACTN4的表达,统计学方法分析ACTN4与临床病理特征的相关性;构建ACTN4 shRNA慢病毒表达载体,利用慢病毒包装技术建立ACTN4稳定低表达的ESCC细胞株,Western blot检测敲低效果,克隆形成实验检测ACTN4敲低对细胞增殖的影响;基于前期黑色素瘤A375细胞中ACTN4敲低的蛋白质组学分析结果,选取候选下游靶蛋白并在ESCC细胞中进行验证。结果免疫组化实验结果显示,ESCC组织中的ACTN4表达量高于正常组织(P<0.0001);成功构建ACTN4 shRNA慢病毒质粒并获得稳定低表达ACTN4的ECA109细胞株;克隆形成实验结果表明,ACTN4敲低抑制ECA109细胞的增殖;ESCC细胞中ACTN4的敲低下调NADH∶泛素氧化还原酶核心亚基V1(NDUFV1)蛋白的表达。结论ESCC细胞中,高表达的ACTN4能够促进细胞增殖,并上调NDUFV1的蛋白表达。

细菌荧光素酶体外发光体系的建立及应用于NADH定量检测

【目的】本研究旨在建立鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)YL荧光素酶:FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系,并对荧光素酶:FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系应用于NADH的定量检测进行初步探索。【方法】利用从鳆发光杆菌提取并经部分纯化的荧光素酶和FMN-NADH氧化还原酶,通过优化体系中各底物的添加量,实现荧光素酶的体外发光。【结果】荧光素酶:FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系为:1mL酶液中添加100μL十二烷醛(27mmol/L)、0.5μLFMN-Na(10mmol/L)、300μLNADH(0.14mmol/L)。NADH与荧光素酶:FMN-NADH氧化还原酶体系的发光强度呈良好的线性关系,其线性范围为1.0×10-10～1.0×10-8mol/L。【结论】荧光素酶:FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系可以简便、灵敏、快速的定量检测NADH,为其进一步应用于环境检测、食品卫生与安全等领域活细菌数量的检测奠定了基础。

二烯丙基三硫通过miR-34a调控人白血病细胞中NADPH氧化酶的机制研究

目的 :研究二烯丙基三硫(diallyl trisuli de,DATS)对人白血病细胞HL-60细胞中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶活性的影响及可能的作用机制。方法:DATS(150μmol/L)作用于HL-60细胞不同时间后,采用硝基四氮唑蓝(nitro blue-tetrazolium,NBT)还原实验检测NADPH氧化酶的活性;实时荧光定量PCR检测DATS对微RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)以及Src、Gab1和Shp-2 mRNA表达的影响及miR-34a对Src、Gab1和Shp-2 mRNA表达的影响;蛋白质印迹法检测DATS及miR-34a对Src、Gab1和Shp-2蛋白磷酸化的影响;细胞计数实验检测DATS和miR-34a对HL-60细胞增殖的影响。结果 :DATS作用于HL-60细胞后能明显提高细胞中NADPH氧化酶的活性,且呈时间依赖性,而Src激酶抑制剂PP2可抑制这种作用;DATS能上调HL-60细胞中miR-34a的表达水平,呈时间依赖性;miR-34a过表达可抑制Src、Gab1和Shp-2 mRNA及磷酸化蛋白的表达;DATS能抑制磷酸化Src、Gab1和Shp-2蛋白的表达水平。DATS和miR-34a过表达能抑制HL-60细胞的增殖,而抑制miR-34a的表达则可提高白血病细胞的增殖能力。结论 :DATS可能通过促进HL-60细胞miR-34a-Src-Gab1-Shp途径调控NADPH的氧化酶活性,从而起到抑制白血病细胞增殖的作用。

50Hz正弦磁场对肌质网钙释放通道Ryanodine受体的影响

目的探讨正弦磁场对提取的骨骼肌肌质网（SR）囊泡钙释放通道（RyR1）的影响。方法采用动态光谱法和同位素标记方法，分别检测了正弦磁场对SR囊泡Ca^2＋释放初速率、[3H]-Ryanodine平衡结合度、还原型辅酶（NADH）的氧化初速率和超氧（O^-·2）产率的影响。结果0．4mT、50Hz正弦磁场辐照SR囊泡30min，由1 mmol/L NADH与1 mmol／LNAD调控的Ca^2＋释放初速率Con组为（10．82周贞洁0．89）pmol·mg^-1 pro·s^-1、MF组为（14．69±1．21）pmol·mg^-1pro·s^-1；上调了35％，[^3H]-Ryan—odine平衡结合度上调15％，由（2．13±0．05）pmol／mg pro上升到（2．45±0．07）pmol／mg pro。另外，该磁场辐照SR囊泡30min，导致NADH的氧化速率上调22％，由（0．88±0．11）×10^-4 FI／s上升到（1．07±0．13）×10^-4 FI／s；O^-·2产率上调32％，由（0．99±0．09）×10^-5 Fl／s上升到（1．31±0．06）×10^-5 FI／s。结论0．4mT正弦磁场2在低氧化还原电势环境下对RyR1有显著的激活，且该磁场促进了NADH氧化酶的活力和O^-·2产率的增加。