AF4/FMR2、IL-10基因多态性与强直性脊柱炎的遗传易感性和免疫浸润相关

目的探索AF4/FMR2、IL-10基因与强直性脊柱炎(AS)的遗传易感性,发现高危因素及筛选高危人群。方法共纳入207例AS患者和321例对照者。选择AF4/FMR2家族基因以及IL-10基因的标签SNP(rs340630、rs241084、rs10865035、rs1698105、rs1800896),提取DNA后进行基因分型,分析其基因型、等位基因分布频率,分析不同遗传模型与AS发病的关系,并进行基因-基因、基因-环境的交互作用分析。结果AS组和对照组在性别、吸烟史、饮酒史、高血压、血沉、C反应蛋白在病例组和对照组均有差异(P<0.05)。AFF1 rs340630的显性模型和隐性模型、AFF3 rs10865035的隐性模型、IL-10 rs1800896的隐性模型在AS组与对照组之间有显著性差异(分别为P=0.031、P=0.010、P=0.031、P=0.019)。基因环境交互分析发现AFF1 rs340630,AFF2 rs241084,AFF3 rs10865035,AFF4 rs1698105,IL-10 rs1800896,吸烟史,饮酒史相互作用模型为最佳模型。AF4/FMR2、IL-10相关基因在AFF4超级延伸复合物、白细胞介素家族信号转导、细胞因子刺激、凋亡等过程富集。免疫相关性分析发现AF4/FMR2、IL-10的表达水平与免疫浸润呈正相关(r>0)。结论AF4/FMR2和IL-10基因多态性与AS的易感性相关,AF4/FMR2和IL-10基因与环境交互引起AS,并通过免疫浸润影响AS的进程。

FMR1基因CGG重复数与流产相关性研究

目的探讨脆性X智力低下1(FMR1)基因的(CGG)n重复序列在育龄女性中的分布以及(CGG)n重复数与流产之间的相关性。方法选取2018年4月至2021年3月就诊于大兴人民医院的2038例孕妇作为研究对象,根据是否有自然流产史分为正常妊娠组(对照组,988例)和流产组(1050例),再根据自然流产次数将流产组分为自然流产(1次)组(520例)和复发性流产(RSA)组(530例)。通过三引物荧光定量PCR技术和毛细管电泳技术对血液样本中的FMR1基因CGG重复数进行检测,统计并分析各组FMR1基因CGG重复数分布情况。结果一般资料分析显示,各组平均年龄比较均无显著性差异(P>0.05)。PCR结果分析显示,流产患者FMR1基因灰区(CGG重复数=45~54)携带率高于正常妊娠组(0.95%vs.0.81%),但无显著性差异(P>0.05);流产组有4例FMR1基因前突变(CGG重复数=55~200)携带者,前突变携带率0.38%,而正常妊娠组无前突变携带者,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。比较正常妊娠组、自然流产(1次)组、RSA组3组FMR1基因CGG重复数分布情况,发现3组均无FMR1基因全突变(CGG重复数>200)携带者。关于FMR1基因灰区突变(CGG重复数=45~54)携带率的分析发现,RSA组(7例,1.32%)携带率最高,其次为正常妊娠组(8例,0.81%)和自然流产组(3例,0.58%),3组两两比较均有显著性差异(P<0.05)。关于前突变(CGG重复数=55~200)携带率分析发现,正常妊娠组无FMR1基因前突变携带者,自然流产有2例(0.38%)前突变携带者,RSA组有2例(0.38%)前突变携带者,两个流产亚组与正常妊娠组比较均有显著性差异(P<0.05)。结论流产人群携带FMR1基因前突变和灰区概率较正常妊娠人群高,对该类人群进行FMR1基因检测在帮助医生指导前突变和灰区携带者的生育计划及产前诊断方面都具有非常深远的意义。

FMR 1基因CGG重复扩增突变在产前筛查高危人群中的分布情况

目的:探讨脆性X染色体智力缺陷(FMR 1)基因CGG重复扩增突变在产前筛查高危人群中的分布情况。方法:选取2020年9月至2022年12月在重庆市妇幼保健院产前诊断中心就诊的365例具有FMR 1基因CGG重复扩增突变高危因素的人群,通过三核苷酸重复引物PCR扩增及毛细管电泳仪检测,计算FMR 1基因CGG重复数,对于阳性结果进行家系分析。结果:365例高危人群中女性279例,男性86例。其中因智力障碍、孤独症、发育迟缓检测的有282例(77.3%),因卵巢功能减退检测的有83例(22.7%),365例检测对象中共发现中间突变7例,前突变3例,全突变3例,FMR 1基因CGG重复扩增突变的检出率为1∶61。结论:FMR 1基因CGG重复扩增突变在产前筛查高危人群中的检出率较高,通过在产前高危人群中检测FMR 1基因CGG重复扩增突变可以有效预防脆性X综合征患儿的出生。

采用PCR方法检测Fmr1基因敲除小鼠的基因型

目的为Fmr1基因敲除小鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。方法设计两对引物扩增野生型Fmr1基因和Fmr1缺陷突变基因的DNA片段,用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度,并将所得基因型结果与经典的western blot方法比较。结果野生型仅在800bp处有一条条带,突变纯合子仅在500bp处有一条条带,杂合子则在500bp和800bp处出现两条条带。用PCR方法获得的Fmr1基因分析结果与经典的western blot方法获得的结果完全一致。结论用PCR方法分析Fmr1基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点。

FMR1基因CGG重复序列频度与反复生育失败或卵巢早衰妇女的相关性研究

目的通过FMR1基因的CGG重复序列的检测探究中国大陆妇女反复生育失败和卵巢早衰的原因。方法本次全国多中心的横断面研究根据异常生育病史和卵巢功能将入选妇女分为3组:A组(不明原因反复生育失败妇女)、B组(卵巢早衰患者)、C组(家族中有自闭症及不明原因智力低下儿出生史的妇女)。测定FMR1基因CGG重复序列。结果本研究共入组2 334例患者,其中A组2 216例,B组70例,C组48例。最常见的CGG重复次数是30(718例,占33.8%)和29(669例,占28.7%)。共发现16例前突变和15例灰区,无全突变。前突变的总发生率为1∶146,分别是A组为1∶369(6/2 216)、B组为1∶35(2/70)、C组为1∶6(8/48)。结论反复生育失败和卵巢早衰妇女的FMR1基因前突变携带者发生风险较高,对这些人群进行FMR1基因筛查,可以帮助医生从基因的角度为她们提供更好的生育咨询。

FMR1基因CGG重复序列多态性与不明原因早期自然流产的相关性研究

目的探讨脆性X智力障碍基因1(FMR1)基因CGG重复序列与不明原因早期自然流产发病机制的相关性。方法收集2015年5月1日至2018年4月1日在北京妇产医院计划生育科就诊的难免流产或需行清宫操作的2 000例患者为自然流产组;同期在北京妇产医院产科就诊的1 480例顺利分娩女性为对照组。两组患者均于孕早期或孕中期抽取外周血,提取基因组DNA,应用FMR1基因Amplide X检测技术进行FMR1基因CGG重复序列数检测。比较两组CGG重复序列情况并加以分析。结果 (1)所有对象的FMR1基因检测未检出全突变病例;自然流产组中CGG重复最大频率等位基因n=30(32.95%),其后依次是29(31.15%)、36(15.60%)、31(5.85%);对照组CGG重复最大频率等位基因为n=30(33.24%),其后依次为29(25.47%)、36(14.73%)、31(8.38%)。自然流产组及对照组CGG重复位点均数比较无显著性差异[(29.33±5.19)vs.(28.73±6.37)](P>0.05)。(2)自然流产组FMR1基因中间型携带率为1∶222,对照组1∶247,组间比较无显著性差异(P>0.05)。自然流产组的脆性X综合征前突变携带频率(1∶400)显著高于对照组(1∶740)(P<0.05)。结论 FMR1基因CGG重复序列前突变与不明原因早期自然流产可能存在相关性。

三十日龄Fmr1基因敲除小鼠的水迷宫实验观察

目的实验对30日龄的Fmr1基因敲除(KO)小鼠的经典Morris水迷宫实验进行观察。方法采用Morris水迷宫实验,测试1月龄KO小鼠与WT小鼠的学习记忆功能。水迷宫实验共训练4 d,记录每天的潜伏期与游泳轨迹,第5天去除平台,记录小鼠停留各象限的时间百分比。根据所获得的数据进行多因素方差分析处理。结果①空间航行实验第1天至第3天实验中KO鼠与WT鼠的潜伏期和穿越平台次数差异无统计学意义(P>0.05);在第4天实验中KO鼠的潜伏期和穿越平台次数比WT鼠差异有统计学意义(P<0.05)。②空间搜索实验4周龄WT鼠在目标象限停留时间比其它象限停留时间长;4周龄KO鼠在第二象限停留时间长。结论 30日龄KO小鼠存在认知功能障碍。

FMR1基因与卵巢早衰的相关性

卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是女性不孕的常见原因之一,其病因及发病机制尚未完全明确。近年来对脆性X智力低下1基因(fragile X mental retardation gene 1,FMR1)的研究发现,FMR1基因与POF之间存在相关性。本文将详细阐述FMR1基因出现突变如何增加POF的发病风险,并对其可能存在的作用机制进行综述分析。

FMR1基因结构与功能

ＦＭＲｌ基因无时空特异性地表达提示它具有管家基因性质，其正常表达对于每个细胞发挥正常的功能都是必不可少的，而与增殖过程和表型发生过程无关。ＦＭＲ１基因在某些组织的时空特异性表达又提示，它也是一种在发育过程起重要作用的调节基因，对于中枢神经系统、生殖系统及其它许多组织的正常发育是必不可少的，可能在细胞的迁移和分化过程中起重要的调控作用。ＦＭＲ１基因表达一种定位于胞浆中的ＲＮＡ结合蛋白ＦＭＲＰ。ＦＭＲＰ可能是一种转录后水平的调控因子，与胞浆中的ｍＲＮＡ结合，在ｍＲＮＡ的转录后加工、转运、翻译以及细胞内定位过程中起调控作用，能够特异性地调控多种下游基因，因而该基因的表达异常能够导致脆性Ｘ综合征所具有的广泛的病理学改变。

30日龄FMR1基因敲除小鼠的旷场行为观察

目的观察30日龄FMR1基因敲除小鼠的旷场行为进行。方法在旷场实验中采取4个区域分割采用VIEWER软件及目测对30日龄的FMR1基因敲除小鼠和野生型小鼠进行旷场行为观察,数据采用多因素方差分析处理。结果采用VIEWER软件分析发现:FMR1基因敲除小鼠在第4区域的停留时间、运动长度、进入格次数、伸头较野生型小鼠显著增加,而在在第1区域的Tailmoves较野生型小鼠显著减少,FMR1基因敲除小鼠在各区的速度,站立不动与野生型小鼠无明显差别。FMR1基因敲除小鼠在第3区域的运动长度和进入格次数也较野生型小鼠显著增加,FMR1基因敲除小鼠在第2区域和第3区域的点头较野生型小鼠显著增加,P<0.05。采用目测分析发现:FMR1基因敲除小鼠在第4区域进入次数较野生型小鼠增加(P<0.05),FMR1基因敲除小鼠跨线次数较野生型小鼠显著增加,P<0.05。结论30日龄FMR1基因敲除小鼠的行为异常,运动性和兴奋性较野生型小鼠增高。采用VIEWER软件较目测更更加灵敏、客观、准确。

GSK3抑制剂氯化锂对FMR1基因敲除小鼠的自主活动的干预作用

目的:探讨GSK3抑制剂氯化锂对FMR1基因敲除小鼠的自主活动的干预作用及机制。方法:通过对90只30日龄FMR1基因敲除小鼠连续腹腔注射不同剂量氯化锂5d,行自主活动行为学实验,观察能否改善KO鼠的过度活动的表型;同时利用免疫印迹技术检测KO及WT鼠的海马和皮层的GSK3β和P-GSK3β的变化。结果:在自主活动行为学实验中,KO鼠的活动次数比WT鼠的活动次数增多而站立次数比WT鼠减少,差异具有统计学意义(P<0.05);使用氯化锂后,KO鼠的活动次数明显减少及站立次数明显增多,差异均有统计学意义(P<0.05);免疫印迹实验结果:KO鼠P-GSK3β表达比WT鼠少,用氯化锂后,KO鼠P-GSK3β的表达增多。KO鼠和WT鼠使用氯化锂后,总的GSK3β无明显改变(P>0.05)。结论:GSK3β的抑制剂氯化锂能改善KO鼠的活动过度的表型,可能与氯化锂导致的P-GSK3β的表达增加有关,对FMR1基因敲除小鼠有治疗作用。

应用多聚酶链式反应快速分析FMR-1基因突变

为了建立一种在先天性智力低下患儿中快速分析脆性X综合征智力低下基因1(Fragile X mentaI retardation gene 1, FMR-1)突变的方法,对先天性智力低下儿童进行脆性X综合征的大面积筛查和诊断,应用复式多聚酶链式反应一次性扩增FMR-1基因的(CGG)n的重复区,分析CGG重复序列的大小,判断FMR-1基因状态(正常、突变前、突变后),对脆性X综合征可疑患儿快速筛查。在113例不明原因的先天性智力低下患儿中,分析有脆性X综合征携带者(FMR-1基因前突变者)7例(2男5女),脆性X综合征患者(FMR-1基因突变者)5例。应用多聚酶链式反应可以对脆性X综合征可疑患儿进行大面积初筛,确定携带者和患者。

胚胎染色体异常与女性年龄和FMR1基因相关性分析

目的探讨稽留流产中胚胎染色体异常的影响因素。方法回顾性分析2017—2020年在首都医科大学附属北京妇产医院计划生育科就诊的稽留流产要求刮宫手术的743名女性患者的临床资料。记录患者的一般情况及胚胎染色体和夫妻双方染色体结果,以及FMR1基因的CGG拷贝数(结果以CGG1和CGG2形式表达)。根据胚胎染色体检查结果将患者分为胚胎染色体异常组(n=409)和胚胎染色体正常组(n=334),比较两组患者的基本情况、实验室检查以及妊娠结局。结果743名患者中,胚胎染色体异常检出率为54.50%(409/743),胚胎染色体异常以染色体三体为主,占82.15%(336/409)。与胚胎染色体正常组比较,胚胎染色体异常组患者的年龄显著升高[(32.66±4.60)vs.(31.17±3.74),P<0.05],孕、产次显著增多[分别为(2.01±1.29)vs.(1.83±1.05);(0.33±1.21)vs.(0.17±0.48)](P<0.05),FMR1基因CGG2序列重复数更小[(28.98±2.16)vs.(29.44±2.14),P<0.05],但FMR1基因CGG2序列均为正常型。以不同年龄分组比较发现,32岁为易发胚胎染色体异常的临界年龄(P<0.05)。Logistics多因素回归分析表明,随着年龄的增长,胚胎染色体异常发生率增加(β=0.04,P<0.05);随着正常型的FMR1基因CGG2拷贝数增加,胚胎染色体异常发生率轻微降低(β=-0.08,P<0.05)。结论年龄为胚胎染色体异常的危险因素,32岁及以后胚胎染色体异常风险增加。正常型的FMR1基因CGG拷贝数不是胚胎染色体异常的危险因素。

用不提取核酸PCR扩增孕妇血浆中胎儿游离DNA的SRY和FMR1基因

目的建立一种不提取核酸的孕妇血浆中胎儿游离DNA的检测方法。方法构建不提取核酸PCR法,用巢式PCR扩增Y染色体上的SRY基因序列和X染色体上的FMR1基因序列,检测44例孕妇血浆中游离DNA。根据随访判断结果的准确性。结果 44例孕妇经随访确认24例有男性胎儿,20例有女性胎儿。24例孕男性胎儿的孕妇血浆标本中有21例扩增出SRY基因和FMR1基因,敏感性为87.5%(21/24);20例孕女性胎儿的孕妇血浆标本中有17例扩增出FMR1基因,敏感性为85.0%(17/20)。结论建立的不提取核酸PCR法具有快速、简便等优点,可用于性连锁遗传病的产前诊断。

秦巴山区智力低下儿童FMR1基因突变研究

目的检测秦巴山区脆性X综合征儿童。方法利用分子生物学技术，对秦巴山区0～14岁智力低下儿童FMR1基因CpG岛甲基化与CGG重复多态性进行检测。结果在56名智力低下男童中，检测出了3例FMR1基因甲基化但CGG重复数在正常范围的患者。对此3例患者及其家系人群体征检查观察到部分成员有脆性X综合征体征；此外，检测的智力低下和对照儿童FMR1基因CGG重复数均在正常范围（分别为16—40，18～37），两组无统计学差异（X^2=29．55，P=0．102）。结论检测出的3例智力低下患者有可能是FMR1基因发生了甲基化而CGG重复数正常的脆性X综合征患者，相对于CGG异常扩增而言，FMR1基因甲基化可能是形成该病症的重要原因。

30日龄Fmr1基因敲除小鼠的跳台实验观察*

目的对30日龄的Fmr1基因敲除小鼠的跳台实验进行观察。方法采用30日龄的KO鼠和WT鼠分别连续进行2 d的跳台实验,根据所获得的数据进行多因素方差分析处理。结果同周龄KO鼠的潜伏期比WT鼠明显少(P<0.05);而KO鼠的错误次数比WT鼠明显多(P<0.05);不同周龄KO鼠或WT鼠的潜伏期、错误次数无差异(P>0.05);第1天KO鼠的潜伏期和错误次数与第2天相比无差异(P>0.05);第1天WT鼠的潜伏期和错误次数与第2天相比有显著差异(P<0.05)。结论 30日龄Fmr1基因敲除小鼠存在认知功能障碍。

Fmr1基因敲除小鼠脏器重量和脏器系数的比较分析

目的通过对Fmr1基因敲除小鼠雌雄两性和FVB小鼠的脏器重量和脏器系数进行比较分析,了解其脏器重量的差异,探讨Fmr1基因对动物生长发育等方面的影响。方法分别测定Fmr1基因敲除小鼠雌雄两性和FVB小鼠内脏器官的绝对重量和脏器系数,并进行统计学处理和分析。结果相同年龄的Fmr1基因敲除小鼠雄性的体重、心、肺、肝和肾的绝对重量均极显著的大于雌性(P<0.01)。雌雄间脏器系数除肾脏(P<0.05)和脑(P<0.01)外,其余无显著差异。与FVB小鼠比较,Fmr1基因敲除小鼠心脏较轻(P<0.01),肾脏(P<0.01)、体重和脑较重(P<0.05)。脏器系数肾脏较大(P<0.01),心脏(P<0.01)、脑和脾(P<0.05)较小。结论Fmr1基因可影响动物的某些脏器重量和脏器系数。

正常人群中FMR-1等位基因的调查及分析

目的 探讨ＦＭＲ１ 等位基因５′不翻译区ＣＧＧ重复序列数检测在筛选中国人群中脆性Ｘ 综合征患者和携带者的作用，以提高脆性Ｘ 综合征的检出率。方法 采用聚合酶链反应技术、３２Ｐ标记（ＣＧＧ）５ 探针杂交技术检测分析ＣＧＧ 重复序列。研究了２７８ 条正常Ｘ 染色体，其分别来自中国的香港、上海、长沙及大连地区。结果 检测发现５０ 多个ＣＧＧ 重复序列的５ 个等位基因，其中４ 个为杂合子女性。结论 ＦＭＲ１ 等位基因在汉族人群中没有区域差异，最常见的重复位点在ＣＧＧ 的２９ ，其次重复位点是３６。这些数据资料为筛选中国人群中脆性Ｘ 综合征的患者和携带者提供了依据。

Fmr1基因敲除小鼠的ABR阈值观察

目的对不同周龄的KO与WT小鼠听阈进行检测并对比,了解KO小鼠的听阈变化。方法采用PCR法鉴定FMR1基因敲除型(KO)纯合子(-/-)及其野生型(WT)纯合子(+/+)FVB近交系小鼠,实验动物150只分两组:(1)KO组(3、4、6、8、10周龄,每周龄15只,共75只;②WT组(3、4、6、8、10周龄,每周龄15,共75只,用于听性脑干反应(ABR)测试。数据及图像的采集:以ABR图形中Ⅱ波的阈值为小鼠的ABR阈值。结果 ABR阈值:3周及4周年龄组小鼠各基因型间KO小鼠的ABR阈值显著高于WT小鼠,差异有统计学意义(P<0.01);6、8、10周各组中各基因型小鼠的KO小鼠和WT小鼠的ABR阈值的差异无统计学意义(P>0.05)。结论幼年期FMR-1 KO小鼠听阈提高,成熟期FMR-1 KO小鼠听阈无异常,KO小鼠ABR的结果与AGS发生的年龄依赖性相一致。

Fmr1基因敲除小鼠的听源性惊厥行为的观察

目的对不同年龄Fmr1基因敲除小鼠的听源性惊厥行为观察。方法使用PCR技术对Fmr1基因敲除小鼠鉴定后对不同周龄的Fmr1基因敲除小鼠和野生型小鼠进行听源性惊厥的观察,数据采用多因素方差分析处理。结果经PCR技术证实脆性X综合征小鼠模型是Fmr1基因敲除小鼠。Fmr1基因敲除小鼠在中央区的惊厥阈值较野生型小鼠显著短。Fmr1基因敲除小鼠鼠受声音刺激后表现为惊恐、奔跑明显的AGS前驱表现,最后发生跌倒、惊厥,呈角弓反张状,最后恢复活动能力或者反复发作,或者导致死亡。结论 Fmr1基因敲除小鼠的行为异常,其兴奋性较野生型小鼠增高。