基于FOK1酶体系的PCR防污染法及在产前诊断中的应用

目的:建立一种有效、实际操作强的聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)防污染法并用于产前检测叶酸利用能力。方法:在1条引物的5′端加入限制性内切酶FOK1的识别序列,将FOK1酶加入PCR扩增反应体系中,切断污染的前PCR产物,考察体系中FOK1酶的用量、酶切扩增一体式反应体系成分的比例及污染量的可控程度,并应用于亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因上C677T突变位点的分析。结果:FOK1酶最佳反应体系却抑制PCR扩增;在TaKaRa反应体系中,0.5 U FOK1酶可完全切割≤0.1μL含有酶切位点的前扩增产物,且成功扩增,而不加入FOK1酶无法控制假阳性结果。FOK1酶切防污染法成功用于MTHFR C677T的测序检测。结论:本方法有效便捷,完全实现了闭管防止PCR污染,不影响后续测序反应,不仅可适用于以PCR扩增为基础的产前诊断等测序分析,更可广泛应用于所有涉及核酸扩增诊断的实验室防治PCR污染中。