中国水仙FOMT2基因及启动子的克隆与分析

为探究花色基因FOMT2在中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)类黄酮代谢途径中的功能作用,以期明确小分子化合物甲基化修饰在水仙类黄酮代谢中的作用,本研究以多花水仙"金盏银台"(Narcissus tazetta var.chinensis‘jinzhanyintai’)不同时期的花器官为材料,提取总RNA,采用RACE与RT-PCR结合的方法,克隆得到NtFOMT2基因的cDNA全长。结果表明:NtFOMT2基因的cDNA全长为1 404 bp,其中5′UTR长度为33 bp,3′UTR长度为279 bp,开放阅读框为1 092 bp,共编码363个氨基酸。定量PCR分析结果表明,NtFOMT2基因表达水平在水仙花器官的不同时期差异很大,其表达模式表现为Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ>Ⅳ。此外,为分析水仙花色素基因的调节因素,以基因组DNA为模板,采用染色体步移法,成功克隆并分析NtFOMT2基因的5’端调控序列。结果表明,NtFOMT2基因启动子序列除包含起始转录位点(transcription start site,TSS)TATA-box、CAAT增强子外,还包含多个顺式作用元件,如ACE、ATCT-motif、G-box、Sp1等多个光响应元件。此外,该启动子序列还含有MYB参与抗旱诱导的结合位点MBS元件、MYB转录因子结合位点等。

类黄酮O-甲基转移酶(FOMT)的生物信息学分析

类黄酮O-甲基转移酶(flavonoid O-methyltransferase,FOMT)是黄酮类化合物后修饰的关键酶,为进一步了解FOMT蛋白功能及特性,本研究采用生物信息学分析方法,对已在NCBI注册的50种FOMT蛋白的理化性质、蛋白质二、三级结构、信号肽等进行分析。结果表明,50种不同来源的FOMT氨基酸数目在186~391;蛋白分子量介于20.8~43.4 kD;理论等电点为4.82~6.37,均为酸性蛋白质;脂肪指数介于84.82~109.01;不稳定系数介于19.85~51.85,其中13种为稳定蛋白质,37种为不稳定蛋白质;亲疏水性分析显示,其中15种为疏水蛋白,25种为亲水蛋白。50种FOMT中仅有葛根来源的F3’-OMT含有跨膜结构,其余均为膜外蛋白。所有FOMT均属于AdoMet-MTase超家族蛋白。该结果以期为今后深入研究FOMT功能和甲基化黄酮类化合物的生物合成提供理论依据。

银杏类黄酮O-甲基转移酶活性的高效液相色谱分析

首次明确了银杏叶片类黄酮生物代谢关键酶O-甲基转移酶(flavonoid O-methyltransferase,FOMT)活性的HPLC测定技术与方法。采集扬州大学银杏种质资源圃银杏雄株成熟叶片,提取粗酶液,根据FOMT催化反应生成S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)的原理,以山奈酚、槲皮素和异鼠李素等3种黄酮苷元为反应底物,采用优化的HPLC体系检测样品中FOMT催化反应生成的SAH峰面积,通过标准曲线求得不同反应底物的FOMT相对活性。FOMT活性反应生成物SAH在1.5～20μg/mL内呈良好的线性关系,RSD为2.1%(n=5),建立了FOMT活性测定优化体系。不同反应底物的FOMT活性表现不同,山奈酚与异鼠李素显著高于槲皮素。FOMT活性HPLC测定方法准确、快速、可靠、灵敏度高。

大肠杆菌表达类黄酮O-甲基转移酶合成槲皮素甲基化衍生物

槲皮素是一种重要的柑橘类黄酮,具有抗菌、抗炎和抗氧化等生物学活性,但水溶性和脂溶性较差,研究表明可通过甲基化提高其代谢稳定性和生物利用度,目前微生物转化法是获得甲基化槲皮素的良好方法。作者筛选了11种不同来源的类黄酮O-甲基转移酶(FOMT),并根据甲基化位点进行分类构建相应的大肠杆菌工程菌,以槲皮素为底物进行发酵分别合成了4种单O-甲基槲皮素(柽柳黄素、鼠李素、异鼠李素和3-O-甲基槲皮素),最高产量分别为31.17、11.17、8.90、52.95 mg/L。随后构建了大肠杆菌共培养体系,分步添加含有MpOMT4和OsNOMT的重组大肠杆菌全细胞催化剂,并通过调整体系中两种菌体的比例和生物量,最终确定菌体细胞质量浓度为24 g/L(以细胞干质量计)、两种菌体质量比为1∶2时,4′,7-二甲氧基槲皮素的最高产量为21.56 mg/L。