一先天性睑裂狭小-倒转型内眦赘皮-上睑下垂综合征家系FOXL2基因的突变检测

目的对一先天性睑裂狭小-倒转型内眦赘皮-上睑下垂综合征(BPES)家系进行FOXL2基因突变筛查,以确定其致病基因。方法抽取先天性BPES家系患者、患者家族成员及正常对照者外周静脉血,提取基因组DNA,PCR扩增,纯化后直接测序检测FOXL2基因的外显子及其与内含子交界处序列,DNAStar软件分析测序结果。结果在该家系患者中检测到C.578A>G错义突变,该突变导致193位氨基酸残基由赖氨酸突变为精氨酸。而家系中的正常人及100例正常对照者的FOXL2基因中均未发现突变。结论FOXL2基因C.578A>G错义突变使赖氨酸突变为精氨酸,导致蛋白质的改变,这可能是该家系BPES的致病原因。

睑裂狭小综合征一家系的FOXL2基因突变研究

目的确定一个常染色体显性遗传的睑裂狭小综合征(BPES)家系的致病基因及其突变位点和类型。方法应用聚合酶链反应和直接测序技术,对来自同一家系的4例BPES患者及家系中6例正常人和50例正常对照者的外周血DNA进行分子遗传学分析,筛查FOXL2基因的外显子序列。结果来自同一家系的4例BPES患者均发现有FOXL2基因892C>T的改变,为无义突变,而家系中6例正常人及50例正常对照者的FOXL2基因中均未发现突变。结论FOXL2基因的一种已知突变可能是该BPES家系的重要致病因素。

MiRNA-520e对HeLa细胞FOXL2基因的靶向调控作用及细胞迁移增殖的影响

目的探讨miRNA-520e对人宫颈癌HeLa细胞FOXL2基因的调控作用及对细胞迁移、增殖的影响。方法应用生物信息学分析软件(Target Scan Human 7.1)预测miRNA-520e可能结合于FOXL2 mRNA 3'UTR端,以HeLa细胞作为试验研究对象,将细胞随机分为阴性对照组(加入无关序列NC Fam mimics)、正常对照组(不加任何干预)、miRNA-520e组(加入miRNA-520e mimics)。运用脂质体法通过Lipofectamine 3000 Reagent将各miRNA mimics转染各组HeLa细胞,48 h后通过实时荧光定量PCR及Western blotting法检测FOXL2 mRNA及蛋白表达;转染24 h后采用细胞划痕试验检测细胞迁移能力,使用ACEA xCELLigence RTCA DP细胞分析仪检测细胞增殖能力。结果 miRNA-520e组HeLa细胞FOXL2 mRNA和蛋白的表达量较正常对照组及阴性对照组降低,且miRNA-520e组细胞的迁移和增殖能力较正常对照组及阴性对照组增强(P均<0.05)。结论 miRNA-520e可抑制HeLa细胞FOXL2 mRNA和蛋白的表达,促进细胞迁移和增殖。

一先天性睑裂狭小综合征家系FOXL2基因的突变检测

目的对1个天性睑裂狭小综合征(BPES)家系成员的FOXL2基因编码序列进行分析,寻找患者的致病基因突变。方法提取患者及家系成员的外周血基因组DNA,应用聚合酶链反应和DNA测序技术检测FOXL2基因编码序列,并与患者家属及50名正常人相应序列进行比对。结果在该家系患者中检测到FOXL2基因c.672_701dup30杂合突变,该突变导致多肽链第224位重复插入10个氨基酸(p.Ala224_Ala234dup)。而家系中的正常人及50例正常对照者的FOXL2基因中均未发现该突变。结论 FOXL2基因c.672_701dup30杂合突变使多聚丙氨酸链延长10个氨基酸,导致蛋白质功能的改变,这可能是该家系BPES的致病原因。

睑裂狭小综合征Ⅱ型一家系未检测到FOXL2基因突变

目的对一个常染色体显性遗传的睑裂狭小综合征Ⅱ型家系FOXL2基因突变进行研究。方法采集一个中国人睑裂狭小综合征Ⅱ型家系的4例患者及家系中5例健康人和30例正常对照者外周静脉血样,提取基因组DNA,参考FOXL2基因序列,设计5对引物,应用PCR和DNA测序技术对FOXI2基因的编码区和启动子区进行扩增和突变检查。结果成功提取了该家系中4例患者和5例健康人与30名正常对照者外周血基因组DNA,分段扩增出了FOXL2基因的编码区及启动子区,但5段测序结果显示该家系中4例患者和5例健康人与30名正常对照者的FOXL2基因测序结果相同。该家系患者FOXL2基因编码区及启动子区均未发现突变。结论该家系睑裂狭小综合征的致病因素不是由FOXL2基因突变引起的。

小睑裂综合征家系FOXL2基因突变检测分析

目的探讨小睑裂综合征(BPES)遗传学发病机制,确定BPES家系临床表型,检测FOXL2基因突变位点。方法收集并追溯调查BPES大家系全体家系成员,对其进行全面体格检查及眼部专科检查;对已收集到的BPES家系中全部患者按照眼科分型标准进行确诊、分型,即遗传学的表型确定;所有现存家系成员性激素水平及卵巢功能检测(女性),女性患者行腹部B超检查,BEPS伴卵巢早衰(POF)患者行人体绒膜促性腺激素(HCG)兴奋试验。全体家系成员取外周血5 m L,常规提取DNA,纯化后的PCR产物送测序。结果该家系共24人,现存17人,其中BPES患者7例,现存6例BPES患者中,女性患者均存在生殖异常,为BEPSⅠ型,进一步完善该家系全部成员的体格检查及女性患者卵巢功能检查、人绒毛膜促性腺激素兴奋试验、血清学检查结果,支持POF的临床诊断。基因测序检测到FOXL2基因:C.429C>A(提前的中止密码)。结论系谱分析表明该家系遗传方式为常染色体显性遗传,常染色体显性BPES存在遗传异质性,同一家系中不同个体间也有不同;基因测序检测到的FOXL2基因:C.429C>A(提前的中止密码)突变为新的突变位点。

FOXL2基因突变研究进展

FOXL2基因是一种单一外显子基因,定位于3q23区域。研究表明其是睑裂狭小、倒转型内眦赘皮和上睑下垂综合征(blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome,BPES)的致病基因,在BPESⅠ型和Ⅱ型患者中均存在FOXL2基因突变。此外,FOXL2基因还是第一个被证实与卵巢维持和卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)有关的人类常染色体上携带的基因。在相当一部分的卵巢早衰患者中可检测到FOXL2基因突变,它可能是卵巢发育中的一种早期调控因子。

过表达FOXL2基因对鸡胚性腺分化的影响

试验旨在研究FOXL2基因对鸡胚性腺分化的影响。本试验分为试验1组、试验2组和空白对照组(鸡胚数量分别为260、100、20枚),试验组通过胚盘下腔注射的方法分别将pLV-FOXL2慢病毒重组质粒、pLV空质粒注入胚胎期第2天的鸡胚,空白对照组不做处理并与试验组一起孵化至出雏,利用CHD1基因遗传性别鉴定的方法对出雏的雏鸡进行性别检测,分析其性腺解剖学、组织学结构变化,并利用免疫组化的方法检测性腺FOXL2和CYP19A1蛋白表达量。结果显示,试验1组遗传性别为公的23只,遗传性别为母的18只,表型性别为公的21只,表型性别为母的18只,其中有2只表型性别不典型,左侧性腺发生变化,朝卵巢结构转变;试验2组遗传性别为公的9只,遗传性别为母的12只,表型性别与遗传性别一致。阳性PCR检测结果显示,试验1组获得阳性个体10个,阳性率为24.4%(10/41);试验2组获得阳性个体8个,阳性率为38.1%(8/21)。性腺解剖学结果显示,阳性pLV-FOXL2雄性鸡胚左侧性腺体积明显大于右侧性腺,表现膨松状态;组织切片结果显示,雄性鸡胚性腺具有典型的卵巢皮质层和髓质层结构;阳性pLV-FOXL2雌性鸡胚性腺的发育无明显变化。免疫组化结果显示,FOXL2和CYP19A1蛋白在试验1组左右侧睾丸中的表达量与空白对照组母鸡卵巢中的表达量相似,显著高于试验2组(P<0.05)。以上结果表明,FOXL2基因可能促进鸡雄性性腺的性反转,在鸡性腺分化和发育过程中发挥着重要的作用。

来航鸡FOXL2基因的真核表达及纯化

【目的】对来航鸡FOXL2基因进行真核表达及纯化,为其生物学功能研究奠定基础。【方法】根据GenBank已发表的来航鸡FOXL2基因序列(GenBank登录号:JF_708868.1)设计引物,以来航鸡全血DNA为模板,PCR扩增FOXL2基因,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后定向克隆于pPICZαA中,获得pPICZαA-FOXL2真核表达载体。将pPICZαA-FOXL2转化毕赤酵母菌GS115,用甲醇进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测。【结果】克隆了918bp的FOXL2基因;成功构建了pPICZαA-FOXL2真核表达载体;实现了FOXL2基因在毕赤酵母菌GS115中的融合表达,获得了分子质量约为37ku的重组蛋白FOXL2,经Western blotting检测其具有较好的生物学活性。【结论】成功地在毕赤酵母中表达了来航鸡FOXL2基因。

中华鳖Foxl2基因克隆及外源性激素对其表达的影响

外源性激素在中华鳖(Pelodiscus sinensis)性别决定有重要作用,为给中华鳖性别决定机制研究提供生物学信息,首次克隆和分析了中华鳖Foxl2 cDNA部分序列。为研究其在遗传和生理水平的差异,以10 mg/kg剂量17α-甲基睾酮(MT)和17β-雌二醇(E_2)分别对中华鳖雌雄个体注射,检测0、6h、12h、24h、48h、7d和14d性腺Foxl2 mRNA表达水平。获得中华鳖Foxl2基因(GenBank登录号:KP734210)部分cDNA长903 bp,共编码300个氨基酸,属于叉头框转录因子家族,参与卵巢发育和功能维持;多重序列比对显示, Foxl2具有典型的FH结构域,与红耳龟的同源性最高,达到99%;系统进化树分析显示,中华鳖Foxl2基因与爬行动物Foxl2基因聚为一个亚支,且与西部锦龟Foxl2基因距离最近。荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,注射E_2后24h,卵巢Foxl2 mRNA表达水平被极显著上调(P<0.001), 7d和14d后,精巢Foxl2 mRNA表达水平极显著上升(P<0.001);注射MT后24h,精巢和卵巢Foxl2 mRNA的表达水平均极显著升高(P<0.001)。结果表明, E_2和MT促进Foxl2表达, E_2促进其表达的性别差异比MT明显。研究可为了解Foxl2的功能及明确外源性激素调控中华鳖Foxl2的分子机制提供基础资料。

FGF8、SHH、FOXL2基因在鸡胚成纤维细胞中的调控作用研究

为了研究SHH、FGF8和FOXL2三个基因在鸡和鹌鹑杂交禽胚胎早期发育中的作用,分别构建鸡SHH、FGF8和FOXL2三个基因共9个RNA干扰载体,构建FGF8基因和SHH基因的过表达载体;将干扰载体和过表达载体分别转染鸡胚成纤维细胞。结果表明:FGF8基因通过MAPK信号通路影响杂交种胚胎早期发育;SHH基因通过Hedgehog信号通路影响杂交种胚胎早期发育;FOXL2基因通过调节DMRT1、SOX9和CYP19等基因的表达变化来影响杂交种胚胎早期发育。本研究可为进一步研究雌性杂交种胚胎早期死亡的原因奠定理论基础。

先天性睑裂狭小综合征患者中FOXL2基因相关遗传学研究进展

先天性睑裂狭小综合征(BPES)是一种罕见的先天性眼睑及颜面部发育异常,典型的眼睑发育异常主要表现为睑裂狭小、逆向内眦赘皮、上睑下垂和内眦间距过宽。BPES分为两型,Ⅰ型表现为眼睑畸形及女性患者不孕,男性患者生育功能正常;Ⅱ型BPES患者临床表现为眼睑发育不良同时男女患者均可生育。通过对BPES患者行遗传学分析发现FOXL2基因是首位致病基因,并且FOXL2基因突变与2种表型BPES发病均有关。随着研究的深入,FOXL2基因型与表型的关系越来越受到关注,而且有研究发现FOXL2基因的同一突变在不同家系,甚至同一家系可能出现不同表型。就FOXL2基因突变与BPES之间的关系进行综述。

FOXL2基因对乳腺癌细胞MCF-7生长的影响

目的检测FOXL2基因的过表达及沉默对乳腺癌细胞系MCF-7细胞生长状况的影响。方法培养乳腺正常细胞系HBL-100和乳腺癌细胞系MCF-7细胞,Trizol法提取两者总RNA,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术分别检测FOXL2基因在这两种细胞中的表达水平。用FOXL2-pEGFP质粒和FOXL2-shRNA质粒转染MCF-7细胞,分别使其过表达或沉默FOXL2,并建立分组为过表达FOXL2(A组)及沉默FOXL2(B组)以及未作转染处理的MCF-7细胞(C组),Western blot检测3组FOXL2蛋白表达量,验证转染是否成功,MTT法测转染后3组细胞的增殖情况。结果 RT-PCR结果显示HBL-100和MCF-7细胞均可转录FOXL2的mRNA,且2^(-ΔΔCt)值> 2,证明FOXL2在MCF-7细胞中表现为上调,且差异有统计学意义(P <0.05)。成功转染MCF-7细胞后,Western blot结果与C组相比,A组细胞中FOXL2蛋白表达量明显增加,B组细胞中FOXL2蛋白表达量明显减少,差异均有统计学意义(P <0.05),可见模型构建成功。MTT法检测3组MCF-7细胞的OD值及细胞增殖率,A组FOXL2基因过表达,MCF-7细胞的增殖能力明显被抑制,而B组的细胞增殖能力增加,差异均有统计学意义(P <0.05)。结论 FOXL2基因在乳腺癌中高表达,且可以抑制乳腺癌细胞的增殖,可能为一个新的肿瘤抑制因子,但仍需要做进一步的研究。

白斑狗鱼FOXL2基因克隆及其表达

为白斑狗鱼(Esox lucius)性别发育机制和功能分析研究提供基础资料,通过克隆FOXL2基因cDNA序列,对其进行相关生物信息学分析,并进行荧光定量PCR检测FOXL2基因在白斑狗鱼不同时期各组织的表达情况。结果表明:以白斑狗鱼卵巢cDNA为模板克隆得1 483bp的FOXL2基因序列,其编码292个氨基酸与鲑形目鱼类的FOXL2氨基酸序列同源性较高;FOXL2基因在白斑狗鱼性腺、鳃和脑中均有不同程度的表达,在其他组织中基本无表达,卵巢表达量是精巢表达量的12倍,呈明显的性别二态性。推测FOXL2基因可能与白斑狗鱼卵巢发育和功能维持相关。

FOXL2基因与蛋鸡卵巢发育的相关性研究

试验采集120、160、220、330、480日龄海兰褐蛋鸡的卵巢,通过石蜡切片观察卵泡发育情况,采用荧光定量PCR检测FOXL2基因在卵巢的表达情况。结果显示:120~480日龄,卵巢重量呈现先增加后减少的趋势,220日龄达到最大;卵巢的初级卵泡数逐渐减少,而次级卵泡数先增加后减少,160日龄次级卵泡数最多;蛋鸡卵泡萎缩率增加,闭锁卵泡数逐渐增多;FOXL2基因的m RNA水平在120~480日龄呈下降趋势,暗示其可能与蛋鸡卵巢和卵泡的发育存在相关性。

中国人睑裂狭小综合征Ⅰ型患者大家系FOXL2基因突变检测

目的研究分析中国人睑裂狭小综合征(BPES)Ⅰ型患者的一个大家系共4代19例的FOXL2基因突变,以明确突变位点及突变类型,确定临床表型与基因型之间的对应关系。方法采集一个中国人BPESⅠ型大家系19例样本外周静脉血EDTA抗凝血样5ml,提取基因组DNA,共设计7对引物,应用聚合酶链反应(PCR)和DNA测序技术对FOXL2基因的外显子和启动子区进行突变筛查。结果该家系中8例患者均检测到FOXL2基因突变,为1002C>G无义突变,11例家系健康人中均无此突变。结论首次在中国人BPESⅠ型大家系患者中发现FOXL2基因1002C>G无义突变,提示该突变可能是BPES综合征Ⅰ型的致病机制之一。

卵巢微囊性间质肿瘤无DICER1基因或FOXL2基因突变

卵巢微囊性间质肿瘤是一种罕见的良性卵巢肿瘤,至今报道不足30例。对于该肿瘤的组织起源尚无确切证据。作者报道了3例卵巢微囊性间质肿瘤,通过基因检测发现,这3例中FOXL2基因和DICER1基因均为野生型,为该肿瘤起源于卵巢间质而非性索来源更添证据。3例患者年龄37~47岁,平均43.3岁,临床表现无特异,患者均没有雌激素升高的症状。肿瘤单侧发生,肉眼观察瘤体局限于卵巢内,切面呈囊实性、囊性或实性。

一个睑裂狭小-倒转型内眦赘皮-上睑下垂综合征家系FOXL2基因突变筛查及蛋白质构象分析

目的研究一个BPES家系进行FOXL2基因的突变分析,探讨BPES发生的分子机制。方法纳入一个先天性BPES大家系和10例正常对照者。首先抽取研究对象外周静脉血2 ml并抽提基因组DNA,然后用四组相互重叠的引物通过聚合酶链反应扩增FOXL2基因的整个编码区和附近的内含子序列并测序。最后用DNAstar软件分析测序结果,ExPASy和Predictprotein软件对比分析突变前后的蛋白质构象。结果这个家族的所有患者都表现出典型的BPES II型特征,包括睑裂狭小、上睑下垂、倒转型内眦赘皮,没有女性卵巢早衰(POF)。在家系所有BPES患者中均发现C.749~778 dup 30的重复突变,而家系中的正常人及10例正常对照者均未发现FOXL2基因突变。蛋白质构象分析示C.749~778 dup 30突变引起翻译后蛋白质增加了10个氨基酸,蛋白质分子量和等电点均升高,α-螺旋所占的比例增加了0.6%,β折叠和无规卷曲所占比例相应下降。结论在BPES家系中发现了一个新的FOXL2基因突变位点,扩大了FOXL2基因突变谱的范围,并为FOXL2蛋白提供了新的的结构功能见解。

极边扁咽齿鱼Foxl2基因的克隆及组织表达

本研究通过分子手段克隆获得极边扁咽齿鱼Foxl2基因,并获得其CDS区序列,长度为915bp,预测编码304个氨基酸,并预测其编码蛋白质的二级、三级结构。利用荧光定量PCR测定foxl2基因在雌雄不同组织中表达量差异,发现该基因在卵巢中的表达量较高,且在脑、眼、鳃中具有一定的表达量。结果表明极边扁咽齿鱼Foxl2基因在卵巢的发育和功能中发挥了重要作用。

静原鸡FOXL2基因PCR扩增及生物信息学分析

为研究FOXL2基因对鸡的性成熟及产蛋性能的影响,试验以优良地方品种静原鸡为研究对象,利用PCR技术成功克隆了静原鸡心脏FOXL2基因的CDS区,其序列长度为918 bp。生物信息学方法分析结果显示,静原鸡FOXL2基因编码了305个氨基酸,分子式为C1491H2267N425O432S15。FOXL2蛋白是亲水性蛋白质,但不存在跨膜区域,不含信号肽。FOXL2蛋白含有28个丝氨酸(Ser)磷酸化位点,含有4个苏氨酸(Thr)磷酸化位点,含有16个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点。FOXL2蛋白在第46~132位氨基酸之间只有1个Forkhead结构。FOXL2蛋白二级结构主要的结构形式为α-螺旋与无规则卷曲。在SWISS-MODEL中建立FOXL2蛋白的三级结构,模型以2ef0.1.A(Ornithine Carbamoyltransferase)蛋白为模板,模板的序列同源性高达99.34%。与其他禽类FOXL2基因CDS区序列进行多序列比对,使用MEGA 7.0软件构建进化树。静原鸡与环颈雉亲缘关系较近,与原鸡的亲缘关系最近。