FOXO基因对印楝素诱导sf9细胞凋亡的影响

【目的】探讨印楝素(azadirachtin,AZA)通过转录因子FOXO诱导草地贪夜蛾卵巢细胞sf9凋亡的分子机制。【方法】将体外培养的草地贪夜蛾卵巢细胞分为AZA处理组和未处理组,采用CCK-8法检测AZA对sf9细胞增殖的影响;透射电镜观察sf9细胞的超微结构变化;流式细胞术分选Annexin V-FITC/PI染色的凋亡细胞;Western blot检测p-FOXO及凋亡相关蛋白的表达情况;RNAi FOXO后,检测FOXO基因表达量与Caspase-3的酶活性变化。【结果】CCK-8检测发现AZA可显著抑制sf9细胞增殖,并呈时间和浓度依赖性;通过透射电镜检测到5 mmol/L AZA可破坏sf9细胞的微观结构,导致细胞核收缩,染色质聚集,细胞质空泡状;流式细胞术分选Annexin V-FITC/PI染色的凋亡细胞,发现AZA诱导sf9细胞凋亡与时间呈正相关;进一步通过Western blot检测凋亡相关蛋白,发现AZA可诱导凋亡相关蛋白Bim和Cleaved Caspase-3的表达水平显著增加,而P-FOXO蛋白表达量降低,FOXO总蛋白表达无明显差异;利用qRT-PCR进一步检测发现,FOXO基因表达量与AZA处理时间呈正相关,在此基础上通过RNAi技术沉默FOXO后,经AZA处理发现Caspase-3的酶活性显著降低。【结论】AZA可通过上调FOXO基因抑制草地贪夜蛾卵巢细胞sf9的增殖并诱导其凋亡。

先天性马蹄内翻足与FoxO基因家族的相关性研究

目的探索先天性马蹄内翻足（ICTEV）与肌肉组织Fox O基因家族（Fox O1、Fox O3和Fox O4）基因表达的相关性。方法将2012～2014年新疆医科大学附属中医医院80例ICTEV患儿及40例健康儿童纳入研究,运用实时荧光定量聚合酶链反应（Real time-q PCR）和Western blot方法检测ICTEV患儿和健康儿童足部肌肉组织Fox O1、Fox O3和Fox O4的基因转录及表达水平。结果 ①与健康儿童比较,ICTEV患儿肌肉组织中Fox O1基因转录水平存在明显下调,差异有统计学意义（P=0.021）;Fox O3、Fox O4基因转录水平无明显变化,差异无统计学意义（P=0.738）。②ICTEV患儿肌肉组织中Fox O1蛋白表达量比健康儿童更少,差异有统计学意义（P=0.017）;Fox O3、Fox O4蛋白表达水平差异无统计学意义（P=0.672）。③与汉族ICTEV患儿比较,维吾尔族ICTEV患儿肌肉组织中Fox O1基因转录水平存在显著下调;Fox O3、Fox O4基因转录水平差异无统计学意义。结论 ICTEV与Fox O基因家族之间存在相关性,Fox O1表达水平的降低可能与ICTEV的发生有关,并提示新疆地区维吾尔族ICTEV患儿更易受Fox O1表达水平的影响。

团头鲂foxO基因家族的序列特征及表达分析

为了研究鱼类foxO(Forkhead box O)基因的功能,基于组学测序及PCR扩增获得了团头鲂(Megalobrama amblycephala)foxO家族7个基因,foxO1a/b、foxO3a/b、foxO4和foxO6a/b的编码序列,分别为1965、1892、1929、1959、1878、1803和2157 bp。SMART结构域分析显示该家族基因属于典型的FoxO家族蛋白,具有保守的Forkhead、FOXO_KIX_bdg和FOXO-TAD结构域。系统进化分析显示,团头鲂FoxO与其他鲤科鱼类的同源基因具有较高的相似性。基于qPCR分析显示7个基因在所检测的9个组织中均有表达,但在各组织间存在表达差异,其中foxO4在血液中表达量最高,foxO6a在肝脏中表达量最高,而foxO6b在脑中表达量最高。在胚胎早期发育过程中,foxO1a和foxO1b、foxO3a和foxO3b、foxO6a和foxO6b的表达模式类似;而foxO4在发育早期,除了体节出现期、眼色素沉淀晚期、体节生成期和受精后10d表达量高外,其他时期表达量都比较低。经急性低氧处理后,团头鲂foxO家族基因的表达水平在所检测的大部分组织中呈现显著上调趋势,尤其是在肌肉组织中。基于JASPAR分析显示foxO家族基因都包含有Hif-1α结合位点,利用双荧光素酶报告系统对foxO1b启动子进行了验证,发现该基因受到Hif-1α调控。这些结果说明foxO基因可能通过Hif-1α介导的途径在团头鲂低氧应激中发挥重要作用。

运动调控高盐膳食果蝇运动能力和生命周期的机制--基于Salt与Foxo基因过表达

目的研究耐力运动对高盐膳食果蝇运动能力和寿命的影响并分析其机制。方法利用上游激活序列(UAS)/半乳糖调节上游启动子元件(Gal4)系统,将雄性野生型w^(1118)、盐(Salt)-UAS-过表达型、叉头转录因子O(Foxo)-UAS-过表达型果蝇分别与雌性arm-Gal4果蝇杂交,收集F1代羽化12 h内的arm-Gal4>w^(1118)、arm-Gal4>Salt-UAS-过表达、arm-Gal4>Foxo-UAS-过表达雄蝇,分为对照组、高盐组、运动组、高盐运动组、Salt组、Salt+运动组、Foxo组、Foxo+高盐组,共8组,每组350只果蝇。第2天龄开始进行运动和高盐干预,在2周龄末检测各指标。结果高盐运动组果蝇的快速攀爬能力、存活率、超氧化物歧化酶(SOD)活力水平、Foxo基因信使核糖核酸(messengerRiboseNucleicAcid,mRNA)表达水平均高于高盐组(P<0.05),丙二醛(MDA)水平、活性氧(ROS)水平和Salt基因mRNA表达水平均低于高盐组(P<0.05);Salt+运动组果蝇的快速攀爬能力、存活率、SOD活力水平、Foxo基因mRNA表达水平均高于Salt组(P<0.05),MDA水平、ROS水平均低于Salt组(P<0.01);Foxo+高盐组果蝇的快速攀爬能力、存活率、SOD活力水平、Foxo基因mRNA表达水平均高于高盐组(P<0.01),MDA水平、ROS水平、Salt基因mRNA表达水平均低于高盐组(P<0.05)。结论Foxo/SOD通路活性增强和Salt基因表达下调是耐力运动后高盐膳食果蝇运动能力增强和寿命延长的重要分子机制;耐力运动能通过提高Foxo/SOD通路活性减缓Salt基因过表达诱发的果蝇运动能力下降和寿命衰减。

血府逐瘀胶囊对心肌缺血模型大鼠心肌SIRT1-FoxO-自噬通路基因表达的影响

目的:探讨血府逐瘀胶囊对心肌缺血模型大鼠心肌SIRT1-FoxO-自噬通路基因表达的影响.方法:将60只大鼠随机分成假手术组(无菌蒸馏水10mL·kg^(-1)灌胃)、模型组(无菌蒸馏水10mL·kg^(-1)灌胃)、血府逐瘀大剂量组(0.04g·kg^(-1))、血府逐瘀中剂量组(0.02g·kg^(-1))、血府逐瘀小剂量组(0.01g·kg^(-1))、L-NAME组(2mg/只腹腔注射).采用荧光定量PCR技术检测各组心肌组织SIRT1、FoxO1、FoxO3、FoxO4基因表达情况.结果:与假手术组相比,模型组、血府逐瘀小剂量组、L-NAME组缺血心肌细胞SIRT1表达水平明显降低(P<0.05);而与模型组、L-NAME组相比,血府逐瘀大、中、小剂量组缺血心肌细胞SIRT1表达水平明显升高(P<0.05).与假手术组相比,模型组、L-NAME组缺血心肌细胞FoxO1、FoxO3、FoxO4表达水平明显升高(P<0.05);血府逐瘀小剂量组缺血心肌细胞FoxO1、FoxO4表达水平明显升高(P<0.05);血府逐瘀大剂量组缺血心肌细胞Fox3表达水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,血府逐瘀大、中剂量组缺血心肌细胞FoxO1、FoxO3、FoxO4表达水平明显降低(P<0.05);血府逐瘀小剂量组缺血心肌细胞FoxO3表达水平明显降低(P<0.05).与L-NAME组相比,血府逐瘀大、中剂量组缺血心肌细胞FoxO1、FoxO3、FoxO4表达水平明显降低(P<0.05);血府逐瘀小剂量组缺血心肌细胞FoxO1、FoxO3表达水平明显降低(P<0.05).结论:血府逐瘀胶囊对冠脉结扎致大鼠心肌缺血有保护作用,其作用可能是通过促进SIRT1基因表达,抑制FoxO1、FoxO3、FoxO4基因表达而发挥作用.

白藜芦醇对过氧化氢诱导滑膜细胞凋亡的作用及机制

摘要目的：研究白藜芦醇（RES）对过氧化氢（H2O2）处理的大鼠佐剂性关节炎（AA）成纤维样滑膜细胞（FLS）凋亡的影响，并探讨Fox基因在其中的作用。方法：采用足趾皮下注射弗氏完全佐剂诱导SD大鼠AA模型，26d成模后，取致炎侧踝关节滑膜组织，应用组织块培养法培养FLS，取第3代FLS用于实验，首先采用CCK-8法观察不同浓度的H2O2对FLS增殖的影响，Annexinv-FITC—PI流式细胞术检测不同浓度的白藜芦醇对H202（20μmol／L）处理的FLS细胞凋亡率；RT-PCR检测各组FLS中FoxO1、Fox04基因水平的表达，免疫印迹检测FLS中Bcl-2、Bax蛋白表达情况。结果：H202（≤20μmol／L）在一定浓度范围内，促进FLS生长；当H202（〉20μmol／L）增加时，Hz02诱导的FLS凋亡数明显增高；随着白藜芦醇浓度的升高，FLS的细胞凋亡率明显升高，白藜芦醇明显降低FoxO1、FoxO4基因水平的表达，增加了细胞内Bcl-2蛋白表达，抑制细胞内Bax表达。结论：白藜芦醇可通过下调FoxO1、FoxO4基因表达，上调抗凋亡Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白的表达，诱导滑膜细胞的凋亡。

N-乙酰半胱氨酸对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的保护及作用机制研究

目的研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)对过氧化氢(H2O2)诱导的骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法采用全骨髓贴壁培养法培养SD大鼠BMSCs,随机分成5组:正常对照组、H2O2处理组、NAC组、NAC+H2O2组和LY294002干预组。流式细胞术检测各组的细胞凋亡率及细胞内活性氧水平;RT-PCR检测各组rBMSCs中FOXO1、FOXO3、FOXO4基因水平的表达;Western blot检测各组rBMSCs中Akt、p-Akt、Bcl-2的表达。结果与正常组相比,H2O2组诱导的rBMSCs凋亡数明显增高,细胞内ROS含量明显增高,FOXO1、FOXO3、FOXO4基因水平的表达量明显下降;NAC明显抑制了rBMSCs凋亡和ROS产生,上调了FOXO1、FOXO3、FOXO4基因水平的表达,增加了细胞内p-Akt和Bcl-2的表达,但LY294002抑制剂明显抑制了NAC对氧化应激后rBMSCs的上述功能。结论 N-乙酰半胱氨酸可通过激活PI3K-Akt信号途径抑制细胞内活性氧的产生、上调FOXO1、FOXO3、FOXO4基因水平及抗凋亡Bcl-2的表达来保护BMSCs免受氧化应激引起的凋亡。

辽宁地区汉族人群中FoxO1基因rs17446614多态性与2型糖尿病的相关性

目的探讨辽宁地区汉族人群中FoxO1基因rs 17446614单核苷酸多态性与2型糖尿病(type 2diabetes mellitus,T2DM)的相关性。方法选取到中国医科大学附属第四医院进行体检的健康人(正常对照)366名及T2DM患者395例,采用分子量阵列技术(MassARRAY)检测FoxO1基因rs 17446614单核苷酸多态性,探讨其与T2DM的相关性。结果糖尿病组与正常对照组rs 17446614基因型均以GG纯合子为多见,分别为78.48%和84.15%,AA纯合子为少见基因型,分别为1.52%和0.27%,两组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。等位基因频率均以G为多见;A等位基因为少见基因型,糖尿病组和正常对照组分别为11.52%和8.06%,两组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论辽宁地区汉族人群FoxO1基因rs 17446614中AA基因型及A等位基因可能是T2DM的易感基因。

脊椎动物FoxO基因亚族的进化

本研究以脊椎动物FoxO作为研究对象,选取NCBI上公布的多个FoxO基因编码蛋白的核苷酸序列,重点分析Fox O蛋白质结构和功能的相似性与差异性,重建FoxO基因的系统发育树并进行选择压力分析,对FoxO基因亚族的起源和进化进行研究分析。结果显示:脊椎动物FoxO蛋白间Forhead结构域十分保守但核定位信号区结构差异较明显,尤其是FoxO6蛋白,并且多个磷酸化位点在哺乳动物FoxO6中缺失,削弱核输出信号,但在斑马鱼和原鸡的FoxO6中未缺失这些位点,推测其胞质定位调控作用仍十分重要。FoxO3中多个磷酸化位点可能与寿命延长作用相关。系统发育树表明FoxO1是FoxO基因的祖先基因,不同FoxO基因进化速率不同。选择压力分析结果显示FoxO基因过程每个位点经历不同的选择压,并且获得25个正选择位点,这些正选择位点可能对FoxO不同基因的形成和新功能的产生中具有十分重要的作用。