Foxo3a基因调控大鼠卵巢颗粒细胞体外发育及预防顺铂对卵巢的毒性作用

目的研究Foxo3a基因对大鼠卵巢颗粒细胞体外发育的调控及其预防顺铂卵巢毒性作用。方法大鼠原代颗粒细胞体外培养,利用HE染色法及免疫荧光法进行原代颗粒细胞鉴定;构建携带Foxo3a基因的重组腺病毒AD-r Foxo3a,利用RT-PCR及Western-blot法检测Foxo3a表达;实验分为3组:实验组(AD-r Foxo3a组)、阴性对照组(r AD组)及空白对照组(Control组),分别绘制各组细胞生长曲线,Western-blot法检测各组cyclin D1、p27、Bax、Bim蛋白表达,利用流式细胞术、Hoechst33342/PI法分别检测细胞周期及细胞凋亡情况,流式细胞术检测各组细胞加入最适浓度顺铂后细胞凋亡情况。结果(1)体外分离培养大鼠原代卵巢颗粒细胞存活率>90%,细胞纯度>95%;(2)重组腺病毒AD-r Foxo3a感染颗粒细胞36 h后Foxo3a基因在m RNA水平高表达,感染48 h后在蛋白水平高表达;(3)实验组细胞增殖受到抑制,G1期细胞比例及细胞凋亡率较空白对照组及实验对照组增加(P<0.01),后两组差异无统计学意义;(3)实验组Bim、p27、cyclin D1蛋白较对照组高表达,而各组Bax蛋白表达无明显差异;(4)加入顺铂24 h后实验组细胞凋亡率高于空白对照组及实验对照组(P<0.01),后两组细胞凋亡率差异无统计学意义。结论过表达Foxo3a基因在体外可能通过促进cyclin D1和p27蛋白表达诱导大鼠卵巢颗粒细胞静止在G1期,通过增加Bim蛋白表达诱导颗粒细胞凋亡;同时过表达Foxo3a基因在体外不能逆转顺铂导致的颗粒细胞凋亡,其对于卵泡发育的调控及预防顺铂对卵巢的毒性作用还有待体内实验进一步研究。

人FOXO3a基因真核表达载体的构建及其功能验证

目的:构建带myc标签的人FOXO3a基因真核表达载体,并对其功能进行初步检测。方法:采用PCR技术,从乳腺文库中扩增人FOXO3a基因,并将其正确插入pXJ-40-myc载体;将重组质粒与空载体分别转染人乳腺癌细胞系ZR75-1、MCF-7后,通过Western印迹检测其表达情况,并用CCK8法测定细胞生长曲线。结果:双酶切和测序鉴定表明myc-FOXO3a真核表达质粒构建成功,转染乳腺癌ZR75-1、MCF-7细胞后目的基因成功表达;细胞生长曲线结果显示,转染myc-FOXO3a的乳腺癌细胞较空载体细胞生长较慢。结论:构建了带myc标签的人FOXO3a基因真核表达载体,为进一步研究FOXO3a在乳腺癌中的功能奠定了基础。

重叠延伸聚合酶链反应克隆大鼠Foxo3a基因及序列测定

目的获得大鼠Foxo3a基因全长编码区基因。方法运用重叠延伸PCR方法从大鼠脾脏总RNA中扩增Foxo3a编码区基因全长,将其插入pMD19-T载体中进行酶切及测序鉴定。结果Foxo3a编码区基因全长2019bp,与GenBank中大鼠Foxo3a基因同源性为99.9%。结论运用重叠延伸PCR技术可成功克隆高GC含量大鼠Foxo3a的cDNA,为进一步研究该基因奠定了基础。

稀有[鱼句]鲫Foxo3a、Foxo3b基因克隆和表达分析

利用RACE技术自稀有[鱼句]鲫的卵巢中克隆叉头蛋白O3a(Foxo3a)、叉头蛋白O3b(Foxo3b)基因的全长cDNA序列,采用RT-PCR、qRT-PCR和原位杂交法检测其组织分布、时序表达、细胞定位和雷帕霉素处理后的表达。结果显示,Foxo3a基因全长cDNA序列为2562bp,包括242bp的5′端非编码区、367bp的3′端非编码区、1953bp的开放阅读框,编码650个氨基酸;Foxo3b基因全长cDNA序列为2804bp,包括470bp的5′端非编码区、375bp的3′端非编码区、1959bp的开放阅读框,编码652个氨基酸。Foxo3a基因只在脑和卵巢中表达,在其他组织中不表达;Foxo3b基因在所检测的组织中均有表达,在脑和卵巢中的表达量较高。随着卵巢的发育,Foxo3a基因表达量呈逐渐升高的趋势,Foxo3b基因表达量未出现显著变化。原位杂交结果显示,Foxo3a、Foxo3b基因定位于卵巢Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ时相的生殖细胞和滤泡细胞中。雷帕霉素处理影响了卵巢中Foxo3a基因的表达,对Foxo3b基因的表达无显著影响。试验结果表明,Foxo3a和Foxo3b基因可能在稀有[鱼句]鲫卵子发生中发挥一定的作用。

FOXO3A基因多态性与广西巴马县长寿现象的相关性研究

目的了解FOXO3A基因8个SNPs位点在广西巴马地区不同人群中的频率,探讨FOXO3A基因多态性与巴马地区长寿现象的相关性。方法采用TaqMan探针实时荧光PCR技术对广西巴马长寿地区177例长寿老人(年龄90～110岁,长寿组)以及巴马非长寿地区148例健康成年人(年龄48～89岁,对照组)的FOXO3A基因进行基因分型。结果长寿组中FOXO3A基因rs2764264、rs9400239、rs13217795、rs2802288、rs2802292位点的小等位基因频率高于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。通过连锁不平衡构建两组人群的FOXO3A基因8个SNPs位点的单体型,发现了GA、AG、TTTGTC、GTCGCT、TCTGTC5个主要的单体型(频率>5%)。与对照组比较,长寿组中单体型AG的频率较高,单体型TTTGTC的频率较低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论FOXO3A基因5个SNPs及2个基于连锁不平衡构建的单体型可能与巴马长寿地区的长寿现象有一定的联系。

FoxO3a、BubR1基因在皮肤自然衰老过程中的表达及意义

目的:探讨FoxO3a和BubR1基因与人皮肤自然衰老的关系。方法:收集80例急腹症手术患者非曝光部位皮肤标本,用反转录(RT)-PCR技术检测皮肤组织中FoxO3a和BubR1mRNA的表达量,并根据年龄分为3组:青年组(<25岁)、中年组(35～45岁)和老年组(>55岁),分析不同年龄组之间各基因表达水平的差异。结果:FoxO3amRNA的表达量随年龄增长而增多,BubR1mRNA随年龄增大而表达降低,两者在3组之间表达差异均有显著性(P<0.01),且两者呈显著负相关(P<0.01)。结论:FoxO3a和BubR1均可能在防止人的皮肤自然衰老过程中有一定的作用。

FoxO3a基因缺失致小鼠脾脏进行性慢性炎性反应的观察

目的观察FoxO3a基因缺失致小鼠脾脏进行性慢性炎性反应。方法分别于16周、24周和12个月称取FoxO3a基因敲除小鼠和对照小鼠体重;于16、24和38周处死各组小鼠,取脾脏,肉眼观察脾脏变化,并制备脾细胞悬液,进行细胞计数,同时取各组小鼠卵巢、肺及皮下等组织,观察其炎性变化。流式细胞术检测24周的FoxO3a基因敲除小鼠和对照小鼠脾细胞中T、B淋巴细胞和Mac-1+细胞数量及百分率;Real-time PCR检测脾细胞中炎性细胞因子S100A8和S100A9基因mRNA的表达水平。结果与对照小鼠相比,FoxO3a基因敲除小鼠脾脏明显肥大,且随年龄增加更加显著,卵巢、肺及皮下等组织内可见大量炎性细胞浸润,脾细胞数明显升高;基因敲除组老年小鼠的体重明显低于对照小鼠;FoxO3a基因敲除小鼠的脾细胞中T、B淋巴细胞数增加明显,但所占脾细胞的百分率无明显增加,Mac-1+细胞数和百分率均明显增加;S100A8和S100A9基因mRNA的表达水平明显高于对照小鼠。结论 FoxO3a基因缺失致小鼠脾脏进行性慢性炎性反应。

Tempol对紫外线照射所致HaCaT细胞损伤保护作用

目的观察氮氧化物4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶(Tempol)对中波紫外线(UVB)照射所致人角质形成细胞(HaCaT细胞)损伤的保护作用,并探讨其发生机制。方法在HaCaT细胞培养系统中加入不同浓度的Tempol进行培养,12h后洗掉培养液中的Tempol,用30mJ/cm2UVB照射细胞后,重新加入培养液继续培养24h。用MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术测定细胞凋亡率。RT-PCR方法测定FoxO3a和BubR1基因的表达。结果UVB照射组与正常对照组相比,细胞增殖活性明显降低(F=27.71,q=13.57,P<0.05),FoxO3amRNA的表达明显增强(F=13.93,q=9.79,P<0.05),BubR1mRNA的表达明显减弱(F=29.69,q=14.54,P<0.05),凋亡率明显增高(χ2=93.69,P<0.05);与UVB照射组相比,不同浓度的Tempol可以恢复UVB照射细胞的增殖能力(q=3.24～13.60,P<0.05),降低照射细胞的凋亡率(χ2=12.02～101.02,P<0.05),下调FoxO3amRNA的表达(q=2.92～9.95,P<0.05),上调BubR1mRNA的表达(q=2.97～14.61,P<0.05)。结论Tem-pol可以保护HaCaT细胞免受UVB照射造成的损伤。