FoxO4靶向siRNA通过减少自噬抑制小鼠神经干细胞向神经元分化

目的:探讨FoxO4是否通过调控自噬影响小鼠神经干细胞(NSCs)的分化能力,寻找调控NSCs分化潜能的有效途径.方法:利用新生BALB/c小鼠提取海马齿状回(DG)NSCs,通过real time RT-PCR和Western Blot实验检测NSCs在分化前后自噬相关基因以及转录因子Forkhead Box O家族(FoxO3、FoxO4和FoxO6)的表达水平;运用基因沉默技术,将电转染后的NSCs分为NC-siRNA组和FoxO4-siRNA组,检测两组NSCs FoxO4 mRNA及蛋白的表达水平,从而验证已转入siRNA序列的目的基因沉默效率;通过real time RT-PCR和Western Blot实验检测NC-siRNA组和FoxO4-siRNA组NSCs自噬相关基因的表达;进一步将两组NSCs分化培养后通过real time RT-PCR实验以及免疫荧光染色检测Tuj1的表达.结果:体外分离培养P0小鼠海马DG区NSCs分化后自噬相关基因ATG3、ATG5、ATG7和Beclin-1 mRNA以及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平被观察到均升高(P<0.01),同时还观察到NSCs分化后FoxO3、FoxO4、FoxO6 mRNA的表达水平均增高(P<0.01),其中转录因子FoxO4的mRNA和蛋白表达增高最为显著(P<0.01).通过运用靶向FoxO4的siRNA转染NSCs后,发现NSCs自噬相关基因ATG3、ATG5、ATG7和Beclin-1 mRNA以及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平均降低(P<0.05),且NSCs中Tuj1表达受到显著抑制(P<0.05).结论:FoxO4基因沉默降低了小鼠海马NSCs中自噬水平,并抑制其向神经元分化.

特女贞苷对高糖诱导人视网膜微血管内皮细胞损伤的抑制作用及其机制

目的探讨特女贞苷对高糖诱导人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)损伤的抑制作用及其机制。方法将hRMECs分为正常对照组、高渗组、高糖组、高糖+低浓度特女贞苷组、高糖+中浓度特女贞苷组和高糖+高浓度特女贞苷组,分别用含5.5 mmol/L葡萄糖、5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇、30 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖+25、50、100μmol/L特女贞苷的培养液培养24 h。另将hRMECs分为高糖+小干扰RNA阴性序列(si-NC)组、高糖+si-叉头框转录因子O4(FOXO4)组、高糖+特女贞苷+pcDNA组、高糖+特女贞苷+pcDNA-FOXO4组,转染相应试剂后分别用含30 mmol/L葡萄糖或100μmol/L特女贞苷+30 mmol/L葡萄糖的培养液培养24 h。采用流式细胞术检测hRMECs细胞凋亡情况;采用硫代巴比妥酸法检测细胞中丙二醛(MDA)质量浓度;采用黄嘌呤氧化酶法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用ELISA法检测细胞培养上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度;采用Western blot法检测细胞中FOXO4蛋白表达水平。结果正常对照组、高渗组、高糖组、高糖+低浓度特女贞苷组、高糖+中浓度特女贞苷组和高糖+高浓度特女贞苷组细胞凋亡率分别为(7.32±0.72)%、(7.44±0.70)%、(23.96±1.32)%、(19.84±1.09)%、(14.13±0.85)%和(9.84±0.70)%。各组细胞凋亡率、MDA质量浓度、SOD活性值、IL-1β质量浓度、TNF-α质量浓度和FOXO4蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=498.545、1186.693、516.629、654.247、638.238、472.655,均P<0.001),其中与高糖组相比,高糖+低、中、高浓度特女贞苷组细胞凋亡率、MDA浓度、IL-1β和TNF-α质量浓度、FOXO4蛋白相对表达量均明显降低,SOD活性值明显升高,且呈剂量依赖性;与高糖+si-NC组相比,高糖+si-FOXO4组FOXO4蛋白相对表达量、细胞凋亡率、MDA浓度、IL-1β和TNF-α质量浓度降低,SOD活性值升高;与高糖+特女贞苷+pcDNA组相比,高糖+特女贞苷+pcDNA-FOXO4组细胞凋亡率、MDA浓度、IL-1β和TNF-α质量浓度、FOXO4蛋白相对表达量均明显升高,SOD活性值明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论特女贞苷可保护hRMECs免受高糖损伤,作用机制与其下调FOX4表达抑制hRMECs凋亡、氧化应激和炎症反应有关。