EuFPS基因表达载体构建及对杜仲遗传转化的研究

本实验用EcoRI和BamHI双酶切植物表达载体pSH737和含有目的基因的pUC—FPS，定向连接得到重组质粒pSH-FPS，将其导入农杆菌EHA105。采用农杆菌介导法对杜仲进行遗传转化，研究了卡那霉素（kanamycin，Kin）浓度、预培养时间、菌液浓度及侵染时间、乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）浓度、共培养时间等对杜仲遗传转化效率的影响。结果表明，选择无菌苗苗龄15d的杜仲下胚轴，卡那霉素浓度50mg/L，农杆菌浓度OD600值0．3～0．6，侵染时间8min，侵染时菌体重悬液中添加50μmol／L乙酰丁香酮，共培养时间3d，抗性芽的获得率最高。对再生植株进行GUS检测发现有45％的植株呈阳性。

浙贝母FPS基因的克隆及其在生物碱代谢中的调控作用研究

目的克隆出浙贝母法呢基焦磷酸合酶(Farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)基因,并对其表达量与生物碱积累量之间的相关性进行分析,以探究FPS基因在浙贝母生物碱合成代谢过程中的调控作用。方法本研究采用RACE技术克隆出浙贝母FPS基因的全长序列;以浙贝母狭叶、宽叶和新梅园3个品种6个组织及10个不同发育时期的新鳞茎为材料,采用RT-qPCR和HPLC-ELSD技术分别测定了FPS基因的表达量与生物碱(浙贝甲素和浙贝乙素)的量,并对其进行相关性分析。结果 FPS基因cDNA序列全长1 629 bp,开放阅读框为1 056 bp,编码351个氨基酸;3个不同浙贝母品种中FPS基因组织特异性表达趋势相同,花中的表达量最高,其次为新鳞茎;不同发育时期新鳞茎FPS基因表达量与生物碱量相关性分析显示,在宽叶和新梅园品种中,FPS基因表达量与浙贝甲素、浙贝乙素量均具有明显的正相关性(相关系数分别为0.289、0.613,0.427、0.622),但在狭叶品种中,该相关性相对较低(0.054、0.236);狭叶、宽叶和新梅园3个品种不同组织中FPS基因表达量与生物碱量具有正相关性(相关系数分别为0.057、0.476,0.085、0.495,0.375、0.432)。结论本研究成功克隆出浙贝母FPS基因的全长序列,FPS基因参与了浙贝母生物碱的合成代谢调控。

FP基因单核苷酸多态性与原发性高血压的相关性研究

目的高血压病人常伴有前列腺素F2α(PGF2α)升高,动物试验表明PGF2α可通过其受体FP调节血压和促进动脉粥样硬化作用,本文探讨PGF2α受体FP基因单核苷酸多态性(SNP)是否与原发性高血压之间存在关联性。方法选取上海徐汇区汉族人群原发性高血压病人332例(男253例,女79例)以及健康对照588例(男309例,女279例),提取外周血白细胞基因组DNΑ,采用Tagman探针PCR基因分型技术,分析了FP基因6个Tagged SNP位点(rs2352043,rs12731181,rs3753380,rs3766355,rs35425451,rs41292960)。结果 rs41292960和rs35425451两个位点发生频率很低(MAF<0.05),试验中未检测到多态性,其余4个SNP位点的基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。病例-对照研究中采用叠加模型分析,应用逻辑回归模型并校正年龄和性别的作用,发现rs12731181 G等位基因位点与高血压有关联的倾向(P=0.0602)。应用广义线性回归模型校正年龄和性别的作用,比较不同基因型个体的收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)水平的差异,发现rs3753380 T等位基因[β(SE)=0.136(0.0746),P=0.068]与血糖存在关联倾向。显性模型分析发现rs3766355 C等位基因与总胆固醇水平升高(TC)[β(SE)=0.122(0.068),P=0.074]存在关联倾向。未发现该基因上的其他位点与收缩压、舒张压及甘油三酯相关(P≥0.16)。结论 FP基因rs12731181 G等位基因与原发性高血压有关联倾向,相关数据需要进一步增加样品验证。

与宿主昆虫液化相关的杆状病毒基因及其蛋白

昆虫被杆状病毒感染后会发生液化现象,这有利于病毒向周围环境扩散。目前在杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒NPV和GV中,发现与昆虫宿主液化相关的基因有组织蛋白酶基因V-cath基因和几丁质酶基因。V-cath基因表达产物在苜蓿银纹夜蛾多角体病毒(AcMNPV)中能特异性降解昆虫细胞内的肌动蛋白。几丁质酶不仅参与了虫体体表面几丁质的降解,同时还参与V-CATH蛋白前体的加工过程,起分子伴侣的作用。对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的研究表明其FP25K基因表达产物通过影响组织蛋白酶的释放与分泌而参与虫体液化。简要综述了此3种基因及其表达产物的结构、功能与特性,并讨论了它们在生产上的应用前景。

白木香法呢基焦磷合酶基因AsFPS1的克隆及表达分析

法呢基焦磷酸合酶(FPS)是倍半萜代谢途径中的关键限速酶之一。本研究在454高通量测序已获得的cDNA序列基础上,PCR扩增其开放阅读框并测序验证;提取三年生白木香根、茎、叶的总RNA及健康和伤害处理的愈伤组织的总RNA,以反转录成的单链cDNA为模板进行荧光定量PCR,检测AsFPS1基因的组织表达特异性及对伤害处理的反应。结果表明,扩增到的AsFPS1基因全长1 342 bp,开放阅读框1 029 bp,编码342个氨基酸。组织表达分析的结果显示,AsFPS1基因主要在根和茎中表达,叶中的表达量较低;该基因同时受物理伤害和结香液处理的诱导,分别在6,12 h达到最高表达水平。通过AsFPS1基因全长cDNA的克隆和表达分析,为后续研究其生物功能及沉香倍半萜合成机制奠定了基础。

AcMNPV大方形多角体突变株的特征研究

对在细胞核中只形成一个几乎与细胞核同样大的立方形多角体突变株ＡｃＭＮＰＶＴＫｍｔ５１３的多角体及其感染细胞，做超薄切片及透射电镜观察，结果表明，在感染细胞核内病毒粒子并没有被包埋到多角体蛋白内，而且多角体蛋白也不具有野生型病毒多角体蛋白那样的晶格结构。生物测定结果表明，经提纯后的突变多角体对虫体无感染力，而感染了突变株病毒的细胞只有弱的感染力。序列测定结果证实，其ｆｐ２５基因无突变发生，且ｆｐ２５基因在Ｓｆ９细胞中的转录也无异常，从而排除了突变与ｆｐ２５基因有关。比较了２６种ＮＰＶ及ＧＶ的多角体蛋白及颗粒体蛋白的氨基酸序列，发现第２５位的甘氨酸是绝对保守的。利用Ｐｒｏｓｉｓ电脑软件对突变株病毒的多角体蛋白进行了二级结构预测并与野生型病毒作了比较，发现突变株病毒多角体蛋白的二级结构与野生型的比较，α螺旋数上升，β折叠数下降，同时，亲水性及抗原性都发生了改变。两种病毒的多角体蛋白通过ＳＤＳＰＡＧＥ分析，其迁移率没有差别。

木薯MeAFP2-like基因的序列特征及表达分析

AFP2基因被认为是植物脱落酸(ABA)信号转导途径的一个重要组分。为了研究木薯中AFP2基因的分子功能,本研究从木薯品种‘新选048’中克隆到一个AFP2基因。结果表明,AFP2-like基因的编码区全长为1 113 bp,编码370个氨基酸,该基因编码的氨基酸符合AFP基因家族的序列特征,含有EAR、NINJA_B和Jas等结构域,该基因被命名为MeAFP2-like。Blastn序列比对发现,MeAFP2-like氨基酸序列和橡胶树HbAFP2 (XP_021636423)序列相似性最高,为91%;系统进化树分析发现MeAFP2-like与橡胶树HbAFP2,蓖麻RcAFP2聚为一支;荧光定量PCR结果表明,MeAFP2-like基因在根中表达量最高,在叶片中表达量居中,在茎秆中表达量最低。这些结果为进一步研究该基因的功能提供了帮助。